Форум по медицинскому праву

Информация о пользователе

Привет, Гость! Войдите или зарегистрируйтесь.


Вы здесь » Форум по медицинскому праву » Федеральное законодательство » Судебное разбирательство дел об установлении отцовства


Судебное разбирательство дел об установлении отцовства

Сообщений 1 страница 4 из 4

1

Установление/Признание отцовства. Суд

Порядок организации и проведения судебно-медицинских экспертиз. № 346н
VII. Особенности порядка производства лабораторных и инструментальных экспертных исследований
81. Особенности порядка производства экспертных исследований по поводу спорного происхождения детей (установления родства):
81.1. целью исследования является решение вопроса о возможности (или невозможности) происхождения ребенка от обоих или одного заявленного родителя. Для этого изучают групповой полиморфизм свойств человеческого организма и на основании законов наследования делают соответствующие выводы;
81.2. взятие крови в исследованиях родства рекомендуется производить при одновременной явке всех заинтересованных лиц и при предъявлении ими документов, удостоверяющих личность каждого. Исключение могут составлять некоторые экспертные исследования, когда родители проживают в разных странах или дальних городах и их одновременная явка невозможна; такой же подход должен быть осуществлен при отсутствии одного из родителей;
81.3. если одного из родителей нет в живых, а кровь из трупа умершего представлена в виде высушенного пятна, то исследование проводят только по тем системам, по которым возможно исключить происхождение ребенка (при отсутствии одного из родителей - это системы AB0, MNSs, Hp, ЭКФ, ГлО и др.). Если же кровь представлена на марле, то в крови предполагаемых родителей изучают только те свойства, которые можно выявить в пятне.
Для решения вопроса о возможном исключении по отдельным системам (MNSs, Hp и др.) при проведении некоторых исследований следует анализировать кровь дедушки и бабушки, а иногда сестер и братьев ребенка;
81.4. некоторые системы у детей формируются лишь к 10 месяцам внеутробной жизни, поэтому исследование следует проводить по достижении ребенком возраста 10 месяцев - 1 года;
81.5. во всех сомнительных случаях, а также при получении данных об исключении отцовства по одной системе рекомендуется повторное взятие крови и проведение вновь тех исследований, которые первично свидетельствовали об исключении отцовства, или если по этим системам были получены сомнительные данные;
81.6. взятие крови осуществляет лаборант в специально отведенном для этих целей помещении в присутствии эксперта;
81.7. экспертное исследование по поводу установления родства производят в следующей последовательности:
изучение представленных документов;
составление плана проведения исследования;
взятие материала для исследования;
исследование с изложением полученных результатов;
составление выводов;
81.8. следует учитывать, что судебно-биологическое исследование по поводу спорного происхождения детей выполняется методом исключения. В то же время позитивное решение вопроса возможно уже при использовании хромосомного и биостатического анализов, молекулярно-генетического исследования;
81.9. при исследованиях крови и слюны в случаях определения спорного происхождения детей у всех проходящих по делу лиц определяют фенотипы (в ряде случаев гаплотипы и генотипы) генетически обусловленных систем крови, собственные группы слюны, категорию выделительства;
81.10. в тех случаях, когда удается установить, что кому-то из заинтересованных в исследовании лиц было произведено переливание крови, то экспертизу проводят, как правило, не ранее чем через 6 месяцев после переливания крови;
81.11. специфичность и активность реагентов, которые должны использоваться в конкретном исследовании, проверяют заранее, используя для этой цели заведомые образцы, содержащие или не содержащие каждый из выявляемых антигенов.
82. Особенности принятия экспертного решения при исключении отцовства (материнства):
82.1. при получении данных, которые могут быть положены в основу последующего исключения отцовства (материнства), обязательно нужно учитывать особенности системы, отвергающей отцовство (наличие слабых свойств, немых аллелей и др.);
82.2. в тех случаях, когда исключение не получено и обсчет данных не проводили, выводы должны содержать фразу, свидетельствующую о том, что в пределах изученных систем вопрос об отцовстве (материнстве) не может быть разрешен.
______________________________________________________
Для информации

Судебно-медицинская библиотека FR
http://www.forens-med.ru/book.php

ООО "ИНВИТРО"
https://www.invitro.ru
Установление биологического родства

2

ПЛЕНУМ ВЕРХОВНОГО СУДА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
 
ПОСТАНОВЛЕНИЕ от 25 октября 1996 г. N 9
 
О ПРИМЕНЕНИИ СУДАМИ СЕМЕЙНОГО КОДЕКСА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПРИ РАССМОТРЕНИИ ДЕЛ ОБ УСТАНОВЛЕНИИ ОТЦОВСТВА И О ВЗЫСКАНИИ АЛИМЕНТОВ
http://base.consultant.ru/cons/cgi/onli … AW;n=66266

 
Пленум Верховного Суда Российской Федерации в целях обеспечения правильного и единообразного применения положений Семейного кодекса Российской Федерации при рассмотрении дел об установлении отцовства, о взыскании алиментов на детей и других членов семьи постановляет дать судам следующие разъяснения:

1. По делам об установлении отцовства, оспаривании отцовства (материнства), о взыскании алиментов суду при разрешении заявленных требований следует исходить из времени возникновения правоотношений сторон и правил введения Семейного кодекса РФ в действие. При этом необходимо учитывать, что в соответствии со ст. 169 СК РФ нормы этого Кодекса применяются к семейным отношениям, возникшим после введения его в действие. К семейным отношениям, возникшим до введения Кодекса в действие, его нормы применяются только к тем правам и обязанностям, которые возникнут после введения кодекса в действие.

2. При рассмотрении дел об установлении отцовства необходимо иметь в виду, что обстоятельства для установления отцовства в судебном порядке, предусмотренные ст. 49 СК РФ, существенно отличаются от тех, которые предусматривались ст. 48 КоБС РСФСР. Учитывая порядок введения в действие и порядок применения ст. 49 СК РФ, установленный п. 1 ст. 168 и п. 1 ст. 169 СК РФ, суд, решая вопрос о том, какой нормой следует руководствоваться при рассмотрении дела об установлении отцовства (ст. 49 СК РФ или ст. 48 КоБС РСФСР), должен исходить из даты рождения ребенка.
Так, в отношении детей, родившихся после введения в действие Семейного кодекса РФ (т.е. 1 марта 1996 г. и после этой даты), суд, исходя из ст. 49 СК РФ, принимает во внимание любые доказательства, с достоверностью подтверждающие происхождение ребенка от конкретного лица. К таким доказательствам относятся любые фактические данные, установленные с использованием средств доказывания, перечисленных в ст. 55 ГПК РФ.
В отношении детей, родившихся до введения в действие Семейного кодекса РФ, суд, решая вопрос об отцовстве, должен руководствоваться ч. 2 ст. 48 КоБС РСФСР, принимая во внимание совместное проживание и ведение общего хозяйства матерью ребенка и ответчиком до рождения ребенка или совместное воспитание либо содержание ими ребенка или доказательства, с достоверностью подтверждающие признание ответчиком отцовства.

3. В случае рождения ребенка у родителей, не состоящих в браке между собой, и при отсутствии совместного заявления родителей вопрос о происхождении ребенка разрешается судом в порядке искового производства по заявлению одного из родителей, опекуна (попечителя) ребенка или по заявлению лица, на иждивении которого находится ребенок, либо по заявлению самого ребенка по достижении им совершеннолетия (ст. 49 СК РФ). Суд также вправе в порядке искового производства установить отцовство по заявлению лица, не состоящего в браке с матерью ребенка, в случае, когда мать ребенка умерла, признана недееспособной, невозможно установить место ее нахождения либо она лишена родительских прав, если орган опеки и попечительства не дал согласие на установление отцовства этого лица в органе записи актов гражданского состояния только на основании его заявления (ч. 1 п. 4 ст. 48 СК РФ).
Поскольку законом не установлен срок исковой давности по делам данной категории, отцовство может быть установлено судом в любое время после рождения ребенка. При этом необходимо учитывать, что в силу п. 5 ст. 48 СК РФ установление отцовства в отношении лица, достигшего возраста 18 лет, допускается только с его согласия, а если оно признано недееспособным, - с согласия его опекуна или органа опеки и попечительства.

4. В случае смерти лица, которое признавало себя отцом ребенка, но не состояло в браке с его матерью, суд в соответствии со ст. 50 СК РФ вправе установить факт признания им отцовства. Такой факт может быть установлен судом по правилам особого производства на основании всесторонне проверенных данных, при условии, что не возникает спора о праве. В случае, если при подаче заявления или рассмотрении дела в порядке особого производства устанавливается наличие спора о праве, подведомственного суду, суд выносит определение об оставлении заявления без рассмотрения, в котором разъясняет заявителю и другим заинтересованным лицам их право разрешить спор в порядке искового производства (ч. 3 ст. 263 ГПК РФ).
В отношении детей, родившихся до 1 октября 1968 г. от лиц, не состоявших в браке между собой, суд вправе установить факт признания отцовства в случае смерти лица, которое признавало себя отцом ребенка, при условии, что ребенок находился на иждивении этого лица к моменту его смерти либо ранее (ст. 3 Закона об утверждении Основ законодательства Союза ССР и союзных республик о браке и семье, ст. 9 Указа Президиума Верховного Совета РСФСР от 17 октября 1969 г.).

5. Учитывая, что Семейный кодекс РФ, так же как и Кодекс о браке и семье РСФСР, не исключает возможности установления происхождения ребенка от лица, не состоящего в браке с его матерью, в случае смерти этого лица, суд вправе в порядке особого производства установить факт отцовства. Такой факт может быть установлен в отношении детей, родившихся 1 марта 1996 г. и позднее, при наличии доказательств, с достоверностью подтверждающих происхождение ребенка от данного лица (ст. 49 СК РФ), а в отношении детей, родившихся в период с 1 октября 1968 г. до 1 марта 1996 г., - при наличии доказательств, подтверждающих хотя бы одно из обстоятельств, перечисленных в ст. 48 КоБС РСФСР.

6. При подготовке дел об установлении отцовства к судебному разбирательству и в ходе рассмотрения дела судья (суд) в необходимых случаях для разъяснения вопросов, связанных с происхождением ребенка, вправе с учетом мнения сторон и обстоятельств по делу назначить экспертизу.
Заключение экспертизы по вопросу о происхождении ребенка, в том числе проведенной методом "генетической дактилоскопии", в силу ч. 3 ст. 86 ГПК РФ является одним из доказательств, которое должно быть оценено судом в совокупности с другими имеющимися в деле доказательствами, поскольку в соответствии с ч. 2 ст. 67 ГПК РФ никакие доказательства не имеют для суда заранее установленной силы.
Исходя из ч. 3 ст. 79 ГПК РФ при уклонении стороны от участия в экспертизе, непредставлении экспертам необходимых материалов и документов для исследования и в иных случаях, если по обстоятельствам дела и без участия этой стороны экспертизу провести невозможно, суд в зависимости от того, какая сторона уклоняется от экспертизы, а также какое для нее она имеет значение, вправе признать факт, для выяснения которого экспертиза была назначена, установленным или опровергнутым. Этот вопрос разрешается судом в каждом конкретном случае в зависимости от того, какая сторона, по каким причинам не явилась на экспертизу или не представила экспертам необходимые предметы исследования, а также какое значение для нее имеет заключение экспертизы, исходя из имеющихся в деле доказательств в их совокупности.

7. Если при рассмотрении дела об установлении отцовства ответчик выразил согласие подать заявление об установлении отцовства в органы записи актов гражданского состояния, суд выясняет, не означает ли это признание ответчиком своего отцовства и, исходя из правил ч. 2 ст. 39 ГПК РФ, обсуждает вопрос о возможности принятия признания ответчиком иска и вынесения в соответствии с ч. 3 ст. 173 ГПК РФ решения об удовлетворении заявленных требований.

8. Если одновременно с иском об установлении отцовства предъявлено требование о взыскании алиментов, в случае удовлетворения иска об установлении отцовства алименты присуждаются со дня предъявления иска, как и по всем делам о взыскании алиментов (п. 2 ст. 107 СК РФ). Вместе с тем необходимо учитывать, что возможность принудительного взыскания средств на содержание ребенка за прошлое время в указанном случае исключается, поскольку до удовлетворения иска об установлении отцовства ответчик в установленном порядке не был признан отцом ребенка.
При удовлетворении требований об установлении отцовства и взыскании алиментов, рассмотренных одновременно, необходимо иметь в виду, что решение в части взыскания алиментов в силу абзаца второго ст. 211 ГПК РФ подлежит немедленному исполнению.

9. В силу ст. 47 СК РФ запись об отце ребенка, произведенная органом записи актов гражданского состояния в соответствии с п. п. 1 и 2 ст. 51 СК РФ, является доказательством происхождения ребенка от указанного в ней лица.
Учитывая это, при рассмотрении иска об установлении отцовства в отношении ребенка, отцом которого значится конкретное лицо (п. п. 1 и 2 ст. 51 СК РФ), оно должно быть привлечено судом к участию в деле, так как в случае удовлетворения заявленных требований прежние сведения об отце должны быть исключены (аннулированы) из актовой записи о рождении ребенка.
Суд в исковом порядке рассматривает и требования об исключении записи об отце, произведенной в актовой записи о рождении в соответствии с п. п. 1 и 2 ст. 51 СК РФ, и внесении новых сведений об отце (то есть об установлении отцовства другого лица), если между заинтересованными лицами (например, между матерью ребенка, лицом, записанным в качестве отца, и фактическим отцом ребенка) отсутствует спор по этому вопросу, поскольку в силу п. 3 ст. 47 ГК РФ аннулирование записи акта гражданского состояния полностью либо в части может быть произведено только на основании решения суда.
При рассмотрении дел об оспаривании записи об отцовстве следует учитывать правило ст. 57 СК РФ о праве ребенка выражать свое мнение.

10. При рассмотрении дел об оспаривании записи об отце (матери) ребенка необходимо иметь в виду, что предусмотренное п. 2 ст. 52 СК РФ правило о невозможности удовлетворения требования лица, записанного отцом ребенка на основании п. 2 ст. 51 СК РФ, об оспаривании своего отцовства, если в момент записи этому лицу было известно, что оно не является отцом ребенка, не исключает его права оспаривать произведенную запись по мотивам нарушения волеизъявления (например, если заявление об установлении отцовства было подано под влиянием угроз, насилия либо в состоянии, когда истец не был способен понимать значение своих действий или руководить ими).
По делам данной категории необходимо также учитывать, что Семейный кодекс РФ (п. 1 ст. 52) не ограничивает каким-либо сроком право на оспаривание в судебном порядке произведенной записи об отце (матери) ребенка. Вместе с тем в случае оспаривания записи об отце (матери), произведенной в отношении ребенка, родившегося до 1 марта 1996 г., суду необходимо иметь в виду, что в силу ч. 5 ст. 49 КоБС РСФСР такая запись могла быть оспорена в течение года с того времени, когда лицу, записанному в качестве отца или матери ребенка, стало или должно было стать известным о произведенной записи.

11. В соответствии с абзацем пятым ст. 122 ГПК РФ судья вправе выдать судебный приказ, если заявлено требование о взыскании алиментов на несовершеннолетних детей, не связанное с установлением отцовства, оспариванием отцовства (материнства) или необходимостью привлечения других заинтересованных лиц. На основании судебного приказа не могут быть взысканы алименты на несовершеннолетних детей в твердой денежной сумме, поскольку решение этого вопроса сопряжено с необходимостью проверки наличия либо отсутствия обстоятельств, с которыми закон связывает возможность такого взыскания (п. п. 1 и 3 ст. 83, п. 4 ст. 143 СК РФ).
В случаях, когда у судьи нет оснований для удовлетворения заявления о выдаче судебного приказа (например, если ответчик не согласен с заявленным требованием (п. 1 ч. 2 ст. 125.8 ГПК РСФСР), если заявлены требования о взыскании алиментов на совершеннолетних нетрудоспособных детей или других членов семьи, если должник выплачивает алименты по решению суда на других лиц либо им производятся выплаты по другим исполнительным документам), судья отказывает в выдаче приказа и разъясняет заявителю его право на предъявление иска по тому же требованию.
Если при подготовке дела по иску о взыскании алиментов к судебному разбирательству или при рассмотрении дела будет установлено, что ответчик выплачивает алименты по решению суда либо им производятся выплаты по другим исполнительным документам, заинтересованные лица извещаются о времени и месте разбирательства дела.

12. При взыскании алиментов в твердой денежной сумме судам необходимо учитывать, что размер алиментов, взыскиваемых на несовершеннолетних детей с родителей (ст. 83 СК РФ), а также с бывших усыновителей при отмене усыновления (п. 4 ст. 143 СК РФ), должен быть определен исходя из максимально возможного сохранения ребенку прежнего уровня его обеспечения с учетом материального и семейного положения сторон и других заслуживающих внимания обстоятельств.
Размер твердой денежной суммы алиментов, взыскиваемых в случаях, предусмотренных п. 2 ст. 85, п. 3 ст. 87, ст. ст. 89, 90, 93 - 97 СК РФ, устанавливается судом исходя из материального и семейного положения плательщика и получателя алиментов и других заслуживающих внимания интересов сторон (ст. 91, п. 2 ст. 98 СК РФ).
При определении материального положения сторон по делам данной категории суд учитывает все источники, образующие их доход.
В указанных выше случаях размер алиментов устанавливается в сумме, соответствующей определенному числу минимальных размеров оплаты труда, и подлежит индексации пропорционально увеличению установленного законом минимального размера оплаты труда, о чем должно быть указано в резолютивной части решения (ст. 117 СК РФ).

13. Требование заинтересованной стороны о взыскании алиментов в твердой денежной сумме либо одновременно в долях и в твердой денежной сумме вместо производимого на основании решения суда (судебного приказа) взыскания алиментов в долевом отношении к заработку (доходу) родителя рассматривается судом в порядке искового производства, а не по правилам, предусмотренным ст. 203 ГПК РФ, поскольку в данном случае должен быть решен вопрос об изменении размера алиментов, а не об изменении способа и порядка исполнения решения суда.

14. При определении размера алиментов, взыскиваемых с родителя на несовершеннолетних детей (п. 2 ст. 81 СК РФ), изменении размера алиментов либо освобождении от их уплаты (п. 1 ст. 119 СК РФ) суд принимает во внимание материальное и семейное положение сторон, а также иные заслуживающие внимания обстоятельства или интересы сторон (например, нетрудоспособность членов семьи, которым по закону сторона обязана доставлять содержание, наступление инвалидности либо наличие заболевания, препятствующего продолжению прежней работы, поступление ребенка на работу либо занятие им предпринимательской деятельностью).
Если алименты на детей были присуждены в долях к заработку и (или) иному доходу ответчика, размер платежей при удовлетворении иска о снижении (увеличении) размера алиментов также должен быть определен в долях, а не в твердой денежной сумме, за исключением взыскания алиментов в случаях, предусмотренных ст. 83 СК РФ.

15. В соответствии с п. 2 ст. 60 СК РФ суд вправе, исходя из интересов детей, по требованию родителя, обязанного уплачивать алименты на несовершеннолетних детей, вынести решение о перечислении не более пятидесяти процентов сумм алиментов, подлежащих выплате, на счета, открытые на имя несовершеннолетних в банках.
Если такое требование заявлено родителем, с которого взыскиваются алименты на основании судебного приказа или решения суда, оно разрешается судом в порядке ст. 203 ГПК РФ.

16. Если при исполнении судебного приказа или решения суда о взыскании алиментов ребенок, на которого они были присуждены, перешел на воспитание и содержание к родителю, выплачивающему на него алименты, а взыскатель не отказался от их получения, освобождение от дальнейшей уплаты алиментов производится не в порядке исполнения решения, а путем предъявления этим родителем соответствующего иска, поскольку в силу закона вопросы взыскания алиментов и освобождения от их уплаты при наличии спора решаются судом в порядке искового производства.
При отказе взыскателя в указанных случаях от дальнейшего взыскания алиментов исполнительное производство подлежит прекращению на основании п. 1 ч. 1 ст. 439 ГПК РФ.

17. Иски о взыскании алиментов на нетрудоспособных, нуждающихся в помощи совершеннолетних детей, могут быть предъявлены самими совершеннолетними, а если они в установленном законом порядке признаны недееспособными, - лицами, назначенными их опекунами.

18. Судам следует иметь в виду, что в силу п. 2 ст. 84 СК РФ расходы на содержание детей, оставшихся без попечения родителей и находящихся в воспитательных, лечебных учреждениях, учреждениях социальной защиты населения и в других соответствующих учреждениях, взыскиваются в пользу этих учреждений только с родителей детей и не подлежат взысканию с других членов семьи, несущих алиментные обязанности по отношению к детям (ст. ст. 93, 94 СК РФ).

19. В соответствии со ст. 80 СК РФ средства на содержание несовершеннолетних детей, взыскиваемые с родителей в судебном порядке, присуждаются до достижения детьми совершеннолетия. Однако, если несовершеннолетний, на которого по судебному приказу или по решению суда взыскиваются алименты, до достижения им возраста 18 лет приобретет дееспособность в полном объеме (п. 2 ст. 21, п. 1 ст. 27 ГК РФ), выплата средств на его содержание в соответствии с п. 2 ст. 120 СК РФ прекращается.

20. Если при рассмотрении дела о взыскании средств на содержание совершеннолетнего дееспособного лица будет установлено, что истец совершил в отношении ответчика умышленное преступление либо имеются доказательства недостойного поведения истца в семье (бывшей семье), суд в соответствии с п. 2 ст. 119 СК РФ вправе отказать во взыскании алиментов.
Под преступлением, совершение которого может явиться основанием к отказу в иске, следует понимать любое умышленное преступление против жизни, здоровья, свободы, чести и достоинства, половой неприкосновенности, иных прав ответчика, а также против его собственности, что должно быть подтверждено вступившим в законную силу приговором суда.
Как недостойное поведение, которое может служить основанием к отказу во взыскании алиментов, в частности, может рассматриваться злоупотребление истцом спиртными напитками или наркотическими средствами, жестокое отношение к членам семьи, иное аморальное поведение в семье (бывшей семье).
При рассмотрении дел данной категории необходимо учитывать, когда было совершено умышленное преступление либо имели место факты недостойного поведения в семье, характер, тяжесть и последствия их совершения, а также дальнейшее поведение истца.
Обстоятельства, перечисленные в п. 2 ст. 119 СК РФ, могут также служить основанием для удовлетворения требования об освобождении от дальнейшей уплаты алиментов, взысканных судом на совершеннолетних дееспособных лиц.

21. Разрешая споры об изменении, расторжении соглашения об уплате алиментов либо о признании такого соглашения недействительным, необходимо учитывать, что к заключению, исполнению, расторжению и признанию недействительным соглашения об уплате алиментов применяются нормы Гражданского кодекса Российской Федерации, регулирующие заключение, исполнение, расторжение и признание недействительными гражданско-правовых сделок (п. 1 ст. 101 СК РФ).
В случае существенного изменения материального или семейного положения сторон, если они не достигли договоренности об изменении или о расторжении в связи с этим соглашения об уплате алиментов, суд вправе по иску заинтересованной стороны с учетом любого заслуживающего внимания интереса каждой из сторон решить вопрос об изменении или о расторжении соглашения.
В соответствии со ст. 102 СК РФ суд также вправе по требованию законного представителя несовершеннолетнего ребенка или совершеннолетнего недееспособного члена семьи, органа опеки и попечительства или прокурора признать недействительным нотариально удостоверенное соглашение об уплате алиментов, если условия предоставления содержания несовершеннолетнему ребенку или совершеннолетнему недееспособному члену семьи существенно нарушают интересы этих лиц, например, установленный соглашением размер алиментов на несовершеннолетнего ниже размера алиментов, которые он мог бы получить при взыскании алиментов в судебном порядке.

22. Помещение супруга, получающего алименты от другого супруга, в дом инвалидов на государственное обеспечение либо передача его на обеспечение (попечение) общественной или других организаций либо частных лиц (например, в случае заключения договора купли-продажи дома (квартиры) с условием пожизненного содержания), может явиться основанием для освобождения плательщика алиментов от их уплаты, если отсутствуют исключительные обстоятельства, делающие необходимыми дополнительные расходы (особый уход, лечение, питание и т.п.), поскольку в силу п. 2 ст. 120 СК РФ право супруга на получение содержания утрачивается, если отпали условия, являющиеся, согласно ст. 89 СК РФ, основанием для получения содержания.
Суд в соответствии с п. 1 ст. 119 СК РФ вправе также снизить размер алиментов, выплачиваемых по ранее вынесенному решению, приняв во внимание характер дополнительных расходов.

23. При рассмотрении исков фактических воспитателей о предоставлении содержания их воспитанниками, а также исков отчима (мачехи) о предоставлении содержания пасынками (падчерицами) необходимо иметь в виду, что в силу ст. ст. 96, 97 СК РФ суд вправе удовлетворить заявленные требования при условии, что истцы являются нетрудоспособными, нуждаются в материальной помощи, которую они не могут получить от своих совершеннолетних трудоспособных детей или от супругов (бывших супругов), надлежащим образом содержали и воспитывали ответчиков не менее пяти лет, а последние достигли совершеннолетия и являются трудоспособными.
Судам необходимо учитывать, что Семейный кодекс РФ, в отличие от КоБС РСФСР (ст. ст. 85 и 80), не предусматривает алиментных обязательств фактических воспитателей в случае отказа от дальнейшего воспитания и содержания своих воспитанников, а также обязанностей отчима и мачехи по содержанию несовершеннолетних пасынков и падчериц, которые находились у них на воспитании или содержании, не имеют родителей или не могут получить достаточных средств на содержание от родителей. Однако это обстоятельство не влечет прекращения выплаты алиментов, взыскиваемых по решениям суда, вынесенным по таким делам до 1 марта 1996 г., поскольку п. 2 ст. 120 СК РФ не установлено такого основания к прекращению алиментных обязательств.

24. Иски лиц, с которых взыскиваются алименты на детей и других членов семьи, об изменении размера алиментов в соответствии со ст. 28 ГПК РФ подсудны суду по месту жительства ответчика (взыскателя).
При изменении ранее установленного судом размера алиментов на детей и других членов семьи взыскание их во вновь установленном размере производится со дня вступления в законную силу вынесенного об этом решения суда.
Суд, изменивший размер взыскиваемых алиментных платежей, должен выслать копию решения суду, первоначально разрешившему дело о взыскании алиментов.

25. Предусмотренная п. 2 ст. 115 СК РФ ответственность лица, обязанного уплачивать алименты по решению суда, за несвоевременную уплату алиментов (уплата неустойки, возмещение убытков) наступает в случае образования задолженности по вине плательщика алиментов. Такая ответственность не может быть возложена на плательщика, если задолженность по алиментам образовалась по вине других лиц, в частности, в связи с несвоевременной выплатой заработной платы, задержкой или неправильным перечислением алиментных сумм банками и т.п.

26. Исключен. - Постановление Пленума Верховного Суда РФ от 06.02.2007 N 6.

 Председатель Верховного Суда Российской Федерации
В.М.ЛЕБЕДЕВ
 Секретарь Пленума, судья Верховного Суда Российской Федерации
В.В.ДЕМИДОВ
 
 

3

"ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНДИВИДУАЛИЗИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ПОЛИМОРФИЗМА НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ МИТОХОНДРАЛЬНОЙ ДНК В СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЕ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛИЧНОСТИ И УСТАНОВЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО РОДСТВА. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ" (УТВ. МИНЗДРАВОМ РФ 25.01.2001 N 2001/4)
http://base.consultant.ru/cons/cgi/onli … P;n=437387

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
РОССИЙСКИЙ ЦЕНТР СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ


ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНДИВИДУАЛИЗИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ПОЛИМОРФИЗМА НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ МИТОХОНДРАЛЬНОЙ ДНК
В СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЕ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛИЧНОСТИ И УСТАНОВЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО РОДСТВА

(N 2001/4, утв. МЗ РФ 25.01.2001)

Настоящие методические указания касаются общих принципов экспертного использования молекулярно-генетических индивидуализирующих систем, основанных на анализе митохондриальной ДНК человека и посвящены регламентированию, в рамках экспертного подхода, методических и аналитических процедур, направленных на исследование полиморфизма нуклеотидных последовательностей митохондриальной ДНК при решении задач судебно-медицинской экспертизы. В частности, описано практическое применение метода при судебно-экспертной идентификации личности и установлении биологического родства. Обобщен и проанализирован накопленный практический опыт, касающийся производства судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств с помощью применения методов молекулярно-генетической индивидуализации человека, основанных на анализе полиморфизма последовательностей амплифицированных фрагментов (ППАФ) митохондриальной ДНК.

Методические указания предназначены для врачей судебно-медицинских экспертов молекулярно-генетического профиля, а также для научных работников-биологов, специализирующихся в области судебной медицины.

Методические указания подготовлены заведующим отделом судебно-медицинских генетических научных и экспертных исследований Российского центра судебно-медицинской экспертизы доктором биологических наук Ивановым П.Л.

Введение

Энзиматическая амплификация в полимеразной цепной реакции тандемно организованных гипервариабельных локусов мини- и микросателлитной природы ядерной (хромосомной) ДНК приводит к формированию индивидуально специфичных продуктов (аллельных фрагментов), различающихся по длине; их дифференцируют путем электрофоретического фракционирования. Этот методический подход подробно описан, и его принципы положены в основу индивидуализирующих систем ПДАФ-типа, широко используемых в судебно-медицинской молекулярно-генетической экспертизе родства и идентификации личности [Иванов П.Л. "Использование индивидуализирующих систем на основе полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления родства." Методические указания.//Минздрав РФ, Москва, 1999 г.].

Между тем, решение судебно-медицинской задачи установления родства с помощью анализа хромосомных ПДАФ-маркеров в определенных случаях оказывается проблематичным - в частности, когда генетическая дистанция, разделяющая родственников оказывается большей, чем одно поколение (т.е. отцы-дети или сибсы). Одним из наиболее перспективных путей решения этой проблемы является переход от анализа хромосомных генов к анализу митохондриальной ДНК (мтДНК).

МтДНК отличает моноклональная природа и матрилинейное наследование. При этом определенные участки мтДНК - так называемые гипервариабельные (ГВ) области, - демонстрируют высокий уровень полиморфизма. Именно такие гипервариабельные участки митохондриального генома, благодаря своему уникальному способу наследования и тому, что они не подвержены рекомбинированию, представляют большой интерес как потенциальные источники новых индивидуализирующих характеристик человека. Их уникальные свойства делают их высокоэффективным инструментом для целей судебно-медицинской экспертизы.

Полиморфизм в нуклеотидных цепях мтДНК обусловлен точковыми нуклеотидными заменами, микроделециями и микроинсерциями. Дифференцировать такие полиморфные варианты с помощью обычных методов электрофореза невозможно, поэтому в индивидуализирующих системах этого типа используются иные принципы дифференциации вариантов, чем в случае ПДАФ-систем. Наиболее радикальный путь - это так называемое секвенирование (англ. - sequencing) амплифицированных фрагментов ДНК, то есть определение первичной структуры олигонуклеотидных продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР), синтезированных на матрице мтДНК. Этот аналитический подход условно можно обозначить сокращением ППАФ - как анализ полиморфизма последовательности амплифицированных фрагментов ДНК.

В настоящее время единственной молекулярно-генетической индивидуализирующей системой, основанной на секвенировании сайт-полиморфных амплифицированных фрагментов ДНК является локус D-петли мтДНК. Судебно-медицинские аспекты технологии типирования ППАФ в D-петле мтДНК были разработаны и впервые реализованы в идентификационной экспертизе в 1992-95 гг. П.Л.Ивановым в соавторстве со специалистами из Великобритании и США в ходе идентификации останков семьи российской императора Николая II [P.Gill, P.Ivanov et al./Nature Genetics, 1994, N 6, V. 2, P. 130-135; P.Ivanov et. al.//Nature Genetics, 1996, N 12, V. 6, P. 417-425].

В настоящих Методических указаниях изложены общие принципы экспертного использования молекулярно-генетической индивидуализирующей системы на основе феномена ППАФ мтДНК человека для целей молекулярно-генетической верификации родственных связей и - как вариант - идентификации личности и экспертизы родства. Рассмотрены принципиальные вопросы, касающиеся специфики лабораторных процедур и интерпретации экспертных данных, а также методические приемы, призванные повысить точность и надежность анализа.

ОПИСАНИЕ МЕТОДА

1. Формула метода

Описанная в настоящем руководстве технология судебно-экспертного типирования ППАФ митохондриальной ДНК, в отличие от ПДАФ-систем ядерной (хромосомной) ДНК, основана на применении не близкородственных, а так называемых трассирующих родословных маркеров, наследуемых по материнской линии.

В общем виде формула метода включает.

На первом этапе выделение из исследуемых объектов биологической природы суммарной клеточной ДНК, ее очистку и введение в качестве матрицы в ПЦР, там происходит направляемый специфическими праймерами избирательный синтез молекулярных копий контрольного участка D-петли мтДНК. Структурно этот участок представляет собой фрагмент молекулы мтДНК человека, картирующийся между позициями (16024-16569/1-576). Этот участок включает два полиморфных района, условно называемых гипервариабельными сегментами 1 и 2 (ГВС1 и ГВС2, англ.: HVR-1 и HVR-2). Синтезируемые на них (амплифицируемые) фрагменты ДНК у разных людей могут иметь разную первичную последовательность нуклеотидов (то есть, обладают свойством индивидуальной специфичности). Это так называемый сайт-полиморфизм (от англ. "site" - участок), который условно можно обозначить как полиморфизм последовательностей фрагментов ДНК, в данном случае - полиморфизм последовательностей амплифицированных фрагментов ДНК (ППАФ).

На втором этапе проводят очистку амплифицированных фрагментов от компонентов реакционной смеси, после чего их вводят в качестве субстрата в так называемые секвенирующие реакции (то есть химические реакции, посредством которых происходит расшифровка первичной структуры олигодезоксинуклеотидов). По окончании реакции терминированные продукты секвенирующих реакций фракционируют под действием высоконапряженного электрического поля в денатурирующих условиях в полиакриламидной или аналогичной гелевой среде по принципу "молекулярного сита".

На третьем этапе проводят сравнительный анализ расшифрованных нуклеотидных последовательностей мтДНК, характеризующих объекты экспертизы. Для этого по определенным правилам сопоставляют полученные индивидуальные профили полиморфизма анализируемых фрагментов ДНК с целью их отождествления или выявления сходства и различий и установления на этом основании определенных факторов, которые могут иметь доказательственное значение по делу.

2. Материально-техническое обеспечение метода

2.1. Требования к помещениям

Судебно-медицинская экспертиза вещественных доказательств с помощью применения индивидуализирующих систем ППАФ-типа, основанных на анализе мтДНК, должна проводиться только в специализированной лаборатории бюро судебно-медицинской экспертизы. Необходимым условием является соответствие материально-технической базы и состояния лабораторных помещений следующим специальным нормам и техническим требованиям.

Главным требованием является обеспечение и строгое соблюдение принципа компартментализации основных стадий производственного процесса. Это означает, что в лаборатории должны быть выделены территориально автономные операционные зоны (компартменты), каждая из которых предназначена для выполнения строго определенного круга операций. Каждая зона должна быть укомплектована спецодеждой, лабораторным и офисным оборудованием, посудой, которые предназначены для использования только в границах данной зоны. Таких зон минимум четыре:

а) лабораторная зона общего назначения: помещения для хранения и препарирования вещественных доказательств, забора крови, выделения и очистки ДНК, мойки и стерилизации посуды; к этой зоне относятся кабинеты экспертов, лаборантские и санитарские помещения, компьютерный зал для обработки данных и оформления документов, аппаратные;

б) чистая зона ПЦР: стерильные, оборудованные УФ-облучателями боксированные помещения с приточно-нагнетательной вентиляцией - для приготовления реагентов, компонентов реакционных смесей, для пробоподготовки и постановки ПЦР;

в) зона для анализа и очистки продуктов амплификации: оборудованные УФ-облучателями и моечной арматурой боксированные помещения с вытяжной вентиляцией - для проведения электрофореза ДНК, окрашивания гелей, элюции и преципитации ДНК, документирования электрофореграмм.

г) Зона "в" должна иметь выделенный компартмент (или лучше, если это отдельная зона) для постановки секвенирующих реакций, очистки продуктов секвенирущих реакций и пробоподготовки для секвенирующего электрофореза.

Компартментализация рабочего процесса, связанного с применением ПЦР, служит абсолютно необходимой мерой предосторожности, которая позволяет свести к минимуму риск случайных загрязнений компонентов реакции ранее амплифицированными продуктами или молекулами ДНК из посторонних источников. Способность ПЦР амплифицировать единичные молекулы ДНК означает, что опасность представляют даже самые незначительные, следовые количества ДНК-контаминатов, которые могут вовлекаться в реакцию как матричные молекулы. Это приводит к искажению результатов исследования.

2.2. Необходимое оборудование

В соответствии с процедурой метода, на первом этапе осуществляется выделение из исследуемых объектов суммарной геномной ДНК, ее очистка, определение концентрации и хранение. Для этого необходимо стандартное лабораторное оборудование для молекулярной биологии: вытяжной шкаф, мини- и микроцентрифуга, термостат, PH-метр, ультрадистиллятор-деионизатор, спектрофотометр или флуориметр, прецизионные весы, микродозаторы автоматические, стеклянная и пластиковая лабораторная посуда, холодильник/морозильник.

Постановка ПЦР требует наличия специального стерильного шкафа-бокса с ультрафиолетовым облучателем, а также ДНК-амплификатора (все позиции выпускаются серийно).

Для электрофоретического фракционирования ДНК необходимы аппараты для электрофореза в гелях агарозы и полиакриламида (соответственно, горизонтальные и вертикальные), печь СВЧ, источники постоянного тока для электрофореза - низковольтный (300 в) и высоковольтный (1000 в), УФ-трансиллюминатор, снабженный документной фотокамерой, прибор для вакуумной сушки гелей.

Анализ результатов электрофореза требует наличия фото- или компьютерной системы видеодокументирования и обработки экспертных данных, а также набора стандартной офисной оргтехники (компьютеры, принтеры, сканер и проч.).

Постановка секвенирующих реакций требует наличия стерильного шкафа-бокса с ультрафиолетовым облучателем, а также ДНК-амплификатора; очистка продуктов секвенирущих реакций и пробоподготовка для секвенирующего электрофореза требует стандартного оснащения: микроцентрифуга, микротермостат, микродозаторы автоматические, стеклянная и пластиковая лабораторная посуда, холодильник/морозильник.

Детекция и анализ фрагментов ДНК - продуктов секвенирующих реакций, выполненных в формате наиболее современных - флуоресцентных - технологий, требует наличия автоматического флуоресцентного секвенатора ДНК - аппаратно-программной системы, который позволяет в автоматическом режиме и с высокой точностью разделять флуоресцентно-меченые фрагменты ДНК на основе различий в их электрофоретических свойствах, регистрировать и обрабатывать данные с использованием встроенных программных средств, что обеспечивает полную расшифровку нуклеотидной последовательности анализируемого фрагмента ДНК. В качестве примера можно указать модели ДНК-секвенаторов ABI 373 и ABI 373A фирмы Applied Biosystems (США), которые, по сути, открыли и развили это высокотехнологическое направление, и более новые, серийно выпускаемые в настоящее время модели ABI 377 PRIZM или ABI 310 PRIZM фирмы ABI/PE Biosystems (США), а также использующие несколько другую реагентную базу модели фирмы Amersham-Pharmacia (США-Швеция) или другие аналоги.

ДНК-секвенатор должен обеспечивать получение надежных, воспроизводимых и предельно высокой степени разрешения (1 нуклеотид) данных, а программное обеспечение - их обработку, архивирование, и хранение как для целей анализа продуктов секвенирующих реакций, так и фрагментного анализа.

3. Технология использования метода

3.1. Получение препаратов ДНК

Предметом судебно-медицинских молекулярно-генетических экспертных исследований являются следы и иные вещественные доказательства по делу - объекты биологического происхождения от трупов и живых лиц. Митохондриальная ДНК содержится во всех клетках организма, поэтому для экспертного исследования в принципе пригодны любые биологические субстраты, в которых сохранились хотя бы единичные ядерные клетки или остатки их цитоплазматического материала: мягкие ткани, жидкая кровь и выделения, высохшие следы крови и выделений, зубы и волосы человека, отчлененные части тела и фрагменты частей тела от неопознанных и расчлененных трупов, фрагменты скелетированных трупов, отдельные кости, костные фрагменты, и др. Поскольку (с определенными оговорками) можно считать, что во всех клетках одного организма митохондриальная ДНК в норме одинакова, это позволяет (с учетом определенных нюансов - см. ниже) проводить отождествление объектов на основании сравнительного ППАФ-анализа биологических образцов разного тканевого происхождения.

С точки зрения экспертного использования, среди множества известных методик выделения и очистки ДНК наибольшее значение имеет классическая фенол-хлороформная экстракция, которая универсальна, обладает хорошей воспроизводимостью и способна обеспечить высокую степень чистоты ДНК; полученные этим методом препараты стабильны и могут храниться при +4 град. C в течение нескольких месяцев. Поэтому методикам выделения ДНК, основанным на органической экстракции следует отдать предпочтение.

В общем случае это многоэтапные процедуры, которые предусматривают разрушение (лизис) клеточных структур и диссоциацию хромосомных нуклеопротеидных комплексов с помощью применения детергентов, протеазную обработку лизата, экстрагирование белков органическими растворителями, отделение водной фазы, содержащей ДНК, и концентрирование и очистку ДНК путем спиртовой преципитации или ультрамикрофильтрации.

Существуют также методики, которые без применения органических растворителей позволяют получать пригодные для использования в ПЦР препараты ДНК. Наиболее распространенным универсальным неорганическим методом, пригодным для экспертного применения является метод с использованием хелатирующего реагента "Килекс" (Chelex R 100). Это экспресс-метод, который вообще не предполагает выделения ДНК в очищенном виде; получаемый препарат, по сути, представляет клеточный лизат, который содержит все исходные компоненты, только в инактивированной форме. Этот метод прост и не требует много времени. Нужно, однако, учитывать, что его надежность, а также качество и стабильность "килексных" препаратов в целом заметно ниже, чем фенол-хлороформных экстрактов.

ПРИМЕЧАНИЕ. Принципиально важное замечание по поводу получения препаратов ДНК для целей типирования ППАФ мтДНК заключается в том, что здесь, в отличие от систем на основе ПДАФ хромосомной ДНК, оказывается неприменим метод селективного выделения ДНК сперматозоидов из смешанных следов, содержащих сперму (см. [Иванов П.Л. "Использование индивидуализирующих систем на основе полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления родства" Методические указания. Минздрав РФ, 1999 г.]. Таким методом можно изолировать только ядерную (хромосомную) ДНК сперматозоидов, но невозможно избирательно выделить их цитоплазматические ДНК-компоненты, к которым относится мтДНК.

3.2. ПЦР-амплификация полиморфных локусов ГВС 1 и ГВС 2 на матрице митохондриальной ДНК

При постановке ПЦР суммарную клеточную ДНК, обычно в количестве 0,5-50 нг, вводят в реакционную смесь, содержащую все необходимые компоненты для работы фермента - термостабильной ДНК-полимеразы (обычно, Taq полимеразы в количестве 1-3 е.а.). Там молекулы мтДНК, присутствующие в препарате суммарной ДНК, будут служить субстратом-матрицей для амплификации нужных локусов. Специфическим компонентом реакции и амплификационной индивидуализирующей системы в целом являются олигонуклеотидные (15-30 звеньев) праймеры - именно они определяют какой генетический локус будет избирательно нарабатываться в ходе реакции. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез новых полинуклеотидных цепей с помощью ДНК-полимеразы осуществляется только между ними, удваивая в каждом цикле количество копий этого участка ДНК. Для проведения полимеразной цепной реакции кроме исходного препарата ДНК, праймеров (в концентрации 0,1-1 мкМ), Taq полимеразы, нужны еще так называемые предшественники ДНК - дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дезоксинуклеотиды) в концентрации 200 мкМ и солевой буферный раствор. Эти компоненты смешивают в реакционной пробирке в микрообъеме (обычно, 25-50 мкл) и помещают в специальный прибор - программируемый термоциклер (ДНК-амплификатор), который обеспечивает необходимый температурный профиль реакции: она претерпевает 25-35 циклов нагрева и охлаждения в интервале температур от 50 до 95 град. C.

Параметры температурного профиля - продолжительность и температура каждой стадии полимеразной реакции зависят от структуры используемых праймеров и потому индивидуальны для каждой конкретной амплификационной индивидуализирующей системы.

Весь процесс длится несколько часов. За время процесса интересующие последовательности ДНК, присутствующие в исходной ДНК-матрице, многократно (миллионократно) копируются ферментом Taq полимеразой, и эти молекулярные копии накапливаются в реакционной смеси.

Амплифицируемые в ходе ПЦР гипервариабельные участки (локусы) мтДНК - это два полиморфных района, условно называемых гипервариабельными сегментами 1 и 2 (ГВС1 и ГВС2, англ.: HVR-I и HVR-2). Структурно эти участки представляют собой фрагменты кольцевой молекулы мтДНК, расположенные в области D-петли между позициями 16024-16365 и 73-340 (границы ГВС1 и ГВС2 в определенной степени условны; указаны наиболее широко распространенные обозначения).

Высокий уровень вариабельности (феномен гиперполиморфизма) здесь обусловлен тем, что у разных людей эти участки могут иметь разную первичную последовательность нуклеотидов. В популяции обнаруживается целый набор вариантов (митотипов), отличающихся друг от друга наличием точковых нуклеотидных замен, микроделеций и микроиксерций. У каждого индивидуума в популяции имеется в норме только один такой вариант-митотип, который этот индивидуум унаследовал по своей материнской линии (поэтому такого рода генетические элементы получили название трассирующих родословных маркеров). Как следствие, полинуклеотидные тракты ГВС1 и ГВС2 мтДНК обладают свойством индивидуальной специфичности. Это так называемый сайт-полиморфизм (от англ. "site" - участок), который условно можно обозначить как полиморфизм последовательностей фрагментов ДНК, в данном случае - полиморфизм последовательностей амплифицированных фрагментов ДНК (ППАФ).

3.3. Фрагментый анализ. Фракционирование продуктов амплификации с помощью гель-электрофореза

Гипервариабельные локусы мтДНК у разных людей имеют разную первичную последовательность нуклеотидов, но практически не отличаются по длине. При амплификации с праймерами, расположенными на флангах такого локуса, образуются фрагменты ДНК одинаковой длины, которые, в то же время, неодинаковы по своей первичной структуре.

Таким образом, в данной аналитической системе индивидуальные образцы мтДНК человека характеризуется наличием амплифицированных фрагментов одинаковой длины, которые могут отличаться отдельными заменами звеньев-нуклеотидов в тех или иных позициях полинуклеотидной цепи. Таких отличий-замен может быть до нескольких десятков, но обычно это 5-10 позиций.

Синтезированные в ходе ПЦР продукты - молекулярные копии полиморфных участков мтДНК накапливаются в реакционной смеси, вследствие чего количественно оказываются доступными для количественной и качественной оценки и последующего анализа. Для этого полученные амплификационные продукты фракционируют по длине с помощью электрофореза в геле агарозы и фрагменты ДНК, амплифицированные в ходе реакции выявляют, используя различные методы детекции. Чаще всего на электрофореграмме визуализируют полосы (зоны локализации фрагментов ДНК одного размера) с помощью флуоресцентного красителя этидиумбромида и затем регистрируют фотографически в УФ свете.

Необходимо подчеркнуть, что в отличие от хромосомных гипервариабельных локусов ПДАФ-типа, индивидуальность митохондриальной ДНК на данном этапе никак не проявляется и потому так называемый амплификационный профиль ДНК не является в данном случае индивидуализирующей геномной характеристикой человека, которому принадлежит анализируемая мтДНК. Для целей отождествления амплифицированных фрагментов мтДНК или выявления в них признаков сходства и различий необходимо установить их первичную структуру и провести сопоставление их нуклеотидных последовательностей.

3.4. Установление первичной структуры амплифицированных фрагментов мтДНК

3.4.1. Очистка амплификационного продукта

Если результаты фрагментного анализа, то есть аналитического электрофореза амплифицированных фрагментов мтДНК признаны удовлетворительными в количественном и качественном отношении, то тогда проводят очистку амплифицированных фрагментов от компонентов реакционной смеси. Это можно сделать с помощью применения стандартных молекулярно-биологических методов очистки нуклеиновых кислот от низкомолекулярных примесей - таких как гель-фильтрация, ультрамембранная фильтрация, методы избирательной адсорбции ДНК на твердых носителях или преципитации ДНК из солевых растворов и, наконец, такой радикальный способ как препаративный гель-электрофорез и последующая элюция ДНК с помощью хаотропных агентов или - в случае использования легкоплавких агарозных сред - путем расплавления геля при температурах ниже температуры плавления ДНК, затем коагуляции расплава фенолом и окончательной очистки с помощью применения одного из вышеперечисленных методов.

Важно отметить, что основная цель описанной процедуры - как можно более полное удаление праймеров, участвовавших в ПЦР-амплификации полиморфных локусов на матрице митохондриальной ДНК. Даже следовые количества посторонних праймеров в препарате могут сильно осложнить анализ и расшифровку его первичной структуры (секвенирование) если применяется методика циклического секвенирования с флуоресцентно мечеными терминаторами полинуклеотидной цепи (см. ниже).

ПРИМЕЧАНИЕ. Любые манипуляции с амплифицированными фрагментами ДНК и в частности, их очистку следует проводить в специально выделенной лабораторной зоне, которая как территориально, так и инвентарно строго отделена от зоны общего назначения (помещений для хранения и препарирования вещественных доказательств, забора крови, выделения и очистки ДНК, мойки и стерилизации посуды) и от чистой зоны, где осуществляется приготовление реагентов и компонентов реакционных смесей, пробоподготовка и постановка ПЦР. Эта мера позволяет свести к минимуму риск случайных загрязнений других препаратов ранее амплифицированными продуктами, которые могут оказаться предпочтительными матрицами для ПЦР и тем самым обусловить ложный результат типирования.

После того как очищенные амплифицированные фрагменты мтДНК получены в виде водного раствора, их можно хранить в течение 2-4 недель при -20 град. C. Для дальнейшего анализа ППАФ аликвоту такого раствора вводят в качестве субстрата в так называемые секвенирующие реакции (то есть химические реакции, посредством которых происходит расшифровка первичной структуры поли- и олигодезоксинуклеотидов).

3.4.2. Постановка секвенирующих реакций

Наиболее современный подход к проведению секвенирующих реакций, детекции и анализу фрагментов ДНК - продуктов секвенирующих реакций, основан на использовании праймеров, несущих на 5-концах флуоресцентную метку или же предшественников ДНК - дезокси- и дидезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTPs/ddNTPs), которые связаны с флуоресцентной меткой. Для работы в этом формате применяют автоматизированные аппаратно-программные системы (секвенаторы ДНК), позволяющие в автоматическом режиме разделять флуоресцентно-меченые фрагменты ДНК на основе различий в их электрофоретических свойствах.

ПРИМЕЧАНИЕ. Использование других (нефлуоресцентных) форматов секвенирующих реакций и методов детекции модифицированных ДНК-продуктов как то: окрашивание нитратом серебра или введение в ДНК радионуклидных меток и последующая авторадиография, предполагают применение так называемых технологий "ручного секвенирования". Методики "ручного секвенирования" требуют другого реактивного и аппаратного обеспечения. Эти методики в настоящем руководстве не рассматриваются - по той причине, что хотя они и находят применение в научно-исследовательских работах, однако они не могут быть рекомендованы для судебно-экспертных целей ввиду их нетехнологичности и недостаточной точности.

В судебно-экспертном ППАФ-анализе как правило используют наиболее высокочувствительный метод секвенирования - так называемое циклическое секвенирование с предшественниками-терминаторами полинуклеотидной цепи. Этот методический подход является одной из модификаций известного базового метода Сэнгера (F.Sanger). Его флуоресцентный формат основан на высокотехнологичных разработках фирмы ABI (Applied Biosystems, США). В настоящее время этой фирмой производятся высокостандартизованные наборы реагентов "ABI Prism Rhodamin Sequencing kit" или "ABI Prism Big Dye Terminator Sequencing kit", которые содержат все необходимые компоненты для постановки секвенирующих реакций, включая ключевые элементы реакционной смеси - высокоэффективную термостабильную ДНК-полимеразу AmpliTaq FS и разные варианты флуоресцентно меченых дидезоксирибонуклеотидов-терминаторов (ddNTPs). При использовании наборов постановка секвенирущей реакции должна выполняться в строгом соответствии с протоколами фирмы-изготовителя. Эти протоколы весьма подробны: они доступны и поэтому в настоящем руководстве нет смысла их пересказывать. Поясним кратко лишь существо самого метода.

3.4.3. Циклическое секвенирование ДНК с использованием Taq полимеразы и флуоресцентно меченых терминаторов полинуклеотидной цепи

В интересующем нас частном случае - при секвенировании последовательностей мтДНК, - в роли матричных молекул выступают очищенные амплифицированные фрагменты мтДНК, полученные на предыдущем этапе анализа и сохраняемые при -20 град. C. Для постановки секвенирующей реакции аликвоту такого раствора вводят в качестве субстрата в реакционную смесь, содержащую все вышеописанные необходимые компоненты.

Особенностью рекомендуемой флуоресцентной технологии Applied Biosystems является, во-первых, применение для мечения новосинтезируемой в секвенирующей реакции ДНК флуоресцентных красителей четырех разных специфичностей (по числу четырех "букв"-нуклеотидов), и во-вторых, использование для достройки полинуклеотидной цепи высокоэффективной термостабильной Taq полимеразы. Все это позволяет провести реакционный процесс Сэнгера сразу для четырех специфичностей в одной пробирке, и вдобавок его многократно повторить на одной и той же матрице, используя циклический процесс, аналогичный ПЦР. Благодаря этим особенностям, в сочетании с автоматизированной обработкой данных, технология Applied Biosystems обеспечивает высокую эффективность, скорость и чувствительность анализа.

При постановке секвенирующей реакции с использованием набора реагентов "АВI Prism Rhodamin Sequencing kit" или "ABI Prism Big Dye Terminator Sequencing kit", очищенные амплифицированные фрагменты мтДНК в водном растворе, полученные на предыдущем этапе анализа, обычно в количестве 2-5 нг, вводят в микрообъем (8 мкл) реакционной смеси, которая содержит все необходимые компоненты для циклической ДНК-полимеразной реакции. Эти молекулы мтДНК будут служить субстратом-матрицей для процесса Сэнгера - то есть ДНК-полимеразной реакции, протекающей в присутствии флуоресцентно меченых дидезоксирибонуклеотидов-терминаторов цепи (ddNTPs) при заданном балансе концентраций dNTPs и ddNTPs. Добавляемым (то есть отсутствующим в наборе) компонентом реакции является один олигонуклеотидный (15-30 звеньев) праймер, который определяет какая последовательность будет "читаться" в ходе секвенирующей реакции. Наличие только одного праймера отличает эту реакцию от стандартной ПЦР. (Напомним, что в ПЦР синтез новых полинуклеотидных цепей с помощью ДНК-полимеразы осуществляется только на участке между двумя праймерами, удваивая в каждом цикле количество копий этого участка ДНК. В случае же постановки полимеразной реакции "по Сэнгеру" в каждом цикле образуется только одна случайным образом абортированная копия секвенируемого фрагмента ДНК). Реакционную микропробирку помещают в программируемый термоциклер (ДНК-амплификатор), который обеспечивает необходимый температурный профиль реакции: она претерпевает 25-35 циклов нагрева и охлаждения в интервале температур от 50 до 95 град. C.

Параметры температурного профиля - продолжительность и температура каждой стадии полимеразной реакции зависят от структуры используемых праймеров и потому индивидуальны для каждой конкретной секвенирующей системы.

3.4.4. Электрофоретическое фракционирование терминированных олигонуклеотидов. Расшифровка первичной структуры мтДНК

Описанный выше реакционный процесс длится несколько часов. За это время терминированные олигонуклеотиды, многократно скопированные с исходной ДНК-матрицы, накапливаются в реакционной смеси. Далее они подлежат очистке и электрофоретическому фракционированию по размеру для определения порядка расположения нуклеотида каждой из четырех специфичностей в составе анализируемой цепи ДНК.

При использовании стандартной процедуры секвенирования ДНК по методу Сэнгера, по окончании реакции терминированные продукты секвенирующих реакций фракционируют под действием высоконапряженного электрического поля в денатурирующих условиях в полиакриламидной среде по принципу "молекулярного сита". Для электрофоретического фракционирования флуоресцентно-меченых терминированных ДНК-продуктов применяют специальный прибор - автоматический флуоресцентный секвенатор ДНК.

Автоматический флуоресцентный секвенатор ДНК - это аппаратно-программная система, позволяющая в автоматическом режиме разделять флуоресцентно-меченые фрагменты ДНК на основе различий в их электрофоретических свойствах. Прибор обеспечивает получение надежных, воспроизводимых и предельно высокой степени разрешения (1 нуклеотид) данных, а также их обработку, архивирование, и хранение. Все процедуры высокостандартизованы. Регистрируемые данные обрабатываются с использованием встроенных программных средств, которые на выходе обеспечивают полную расшифровку нуклеотидной последовательности анализируемого фрагмента мтДНК в области ГВС1 и/или ГВС2. Эта последовательность может быть записана в стандартном виде как последовательность однобуквенных символов IUPAC для соответствующих дезоксирибонуклеотидов: А; Т; Г; С (англ.: A; T; G; C).

ПРИМЕЧАНИЕ. Работа на приборе требует обучения и приобретения комплекса специальных технических навыков. Обсуждение этих вопросов не входит в задачу данного руководства.

3.5. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей мтДНК в объектах экспертизы

3.5.1. Номенклатура митотипов

Индивидуальность мтДНК реализуется в виде ее индивидуально-специфичной первичной структуры (последовательности нуклеотидов в составе полинуклеотидной цепи). Иными словами, полинуклеотидная цепь мтДНК у разных людей может иметь разную последовательность нуклеотидных звеньев. Каждый конкретный вариант нуклеотидной последовательности, установленный для данного полиморфного участка (локуса) молекулы мтДНК представляет собой так называемый митотип. Локальный митотип является в данном случае индивидуализирующей характеристикой человека, которому принадлежит анализируемая мтДНК. Для целей отождествления митотипов или выявления в них признаков сходства и различий проводят их сравнительный анализ.

По сложившейся и рекомендуемой практике, сравнение индивидуализирующих характеристик - митотипов - осуществляют не напрямую, а опосредованно, путем сопоставления каждой расшифрованной последовательности сначала с соответствующим участком последовательности нуклеотидов в так называемой референтной последовательности мтДНК, выполняющей функцию своеобразного эталона. За такую последовательность принят исторически первый полностью расшифрованный митотип, описанный в 1981 г. С.Андерсоном и соавт. [Anderson S., Bankier A.T., Barrell B.G. et el.//Nature (1981), Vol. 290., P. 457-465], который получил наименование "Кембриджская референтная последовательность" или CRS (англ.: Cambridge Reference Sequence).

Сравнение анализируемого митотипа с CRS позволяет записать (зарегистрировать) этот митотип в универсальной, удобной для последующих сравнений форме, а именно - в виде таблицы позиционных отличий в нуклеотидной последовательности анализируемой мтДНК от CRS. Например запись: "ГВС 1: L 16126(T -> C), 16163(A -> G); ГВС 2: L 73(A -> G), 263(T -> C)" означает, что при сравнении L-цепи Кембриджской референтной последовательности и нуклеотидной последовательности локуса ГВС 1 и ГВС 2 молекулы мтДНК у данного индивидуума, в нуклеотидной последовательности мтДНК этого человека обнаружены указанные отличия. В приведенном примере это нуклеотидные замены типа транзиции в позициях 16126, 16163, 73 и 263. Митотип можно записать и в более короткой форме, указав только замещающие нуклеотиды: "ГВС 1: L 16126(C); 16163(G); ГВС 2: L 73(G), 263(C)".

Кроме точковых замен типа транзиций и (более редких) трансверсий, могут наблюдаться и другие варианты отличий. Это делеции, которые при записи митотипа обозначаются латинской буквой d: "L 16174d", и инсерции, которые принято обозначать добавлением к номеру предшествующей позиции порядкового числительного после точки: "L 309.1C". В последнем примере запись означает, что после нуклеотида с порядковым номером 309 в цепи исследованной мтДНК есть один "лишний", то есть отсутствующий в Кембриджской последовательности, нуклеотид C.

3.5.2. Сравнение установленных митотипов

Как явствует из предыдущего раздела, сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей мтДНК в объектах экспертизы сводится к сравнительному анализу митотипов, установленных в этих объектах. Такой анализ включает сопоставление и оценку различий или совпадения комплекса признаков-митотипов с целью разрешения вопросов, поставленных перед экспертизой.

Выше уже говорилось, что сравнение анализируемых митотипов начинают с сопоставления их с референтной последовательностью CRS. Иными словами, полученный результат как бы приводят к "общему знаменателю", то есть нормируют. Это позволяет записать (зарегистрировать) любой митотип в универсальной, удобной для последующих сравнений форме, а именно - в виде таблицы позиционных отличий в нуклеотидной последовательности анализируемой мтДНК от CRS. Затем эти нормированные данные, полученные для объектов анализа сравнивают между собой и определяют одинаковы или неодинаковы интересующие митотипы.

Понятно, что вопрос о том, одинаковы или неодинаковы митотипы (профили полиморфизма), в препаратах ДНК, выделенных из объектов экспертизы (скажем, из биологических следов на вещественных доказательствах и из крови проходящих по делу лиц) является в экспертизе ключевым. Это очевидно, поскольку от того, как будет интерпретирован результат сравнения, зависит экспертный вывод: в одном случае это неисключение, а в другом - исключение причастности данного лица к происхождению следов. Между тем, вопрос о сходстве или несходстве митотипов таит в себе определенные трудности, могущие привести к неверному выводу.

В общем случае одинаковость или неодинаковость митотипов устанавливают на основании совпадения или несовпадения характеризующих их позиционных отличий от CRS. Если совпадение 100%-ное, то вывод ясен - в объектах экспертизы установлен один и тот же комплекс признаков мтДНК (митотип) и значит можно переходить к оценке статистической значимости этого совпадения (см. ниже). Если есть множественные отличия (скажем, для двух ГВС - более трех точковых отличий), то здесь тоже все ясно: митотипы разные. Однако трудности могут представлять случаи, когда различия хотя и обнаруживаются, но не являются вполне однозначными.

3.5.3. Межтканевой полиморфизм мтДНК

Одним из примеров может служить межтканевой полиморфизм мтДНК. Митохондриальная ДНК содержится во всех клетках организма, поэтому для экспертного исследования, в принципе, пригодны любые биологические субстраты, в которых сохранились хотя бы единичные ядерные клетки или остатки их цитоплазматического материала: мягкие ткани, жидкая кровь и выделения, высохшие следы крови и выделений, зубы и волосы человека, отчлененные части тела и фрагменты частей тела от неопознанных и расчлененных трупов, фрагменты скелетированных трупов, отдельные кости, костные фрагменты, и др. В целом можно считать, что во всех клетках одного организма митохондриальная ДНК в норме одинакова. Это в большинстве случаев позволяет проводить отождествление объектов на основании сравнительного ППАФ-анализа биологических образцов разного тканевого происхождения. Тем не менее, в отдельных случаях могут наблюдаться единичные точковые отличия в нуклеотидных последовательностях мтДНК, выделенной из какой-нибудь одной ткани организма от других тканей.

Межтканевой полиморфизм - явление избирательное, то есть различия могут проявиться только в весьма ограниченном наборе тканей, тогда как во всех остальных тканях данного организма митотип будет одинаков. Поэтому при сомнительном результате следует провести типирование мтДНК в ряде контрольных образцов.

3.5.4. Явление гетероплазмии

В ходе сравнительного анализа последовательностей мтДНК из скелетированных останков последней Российской императорской семьи, было показано [P.Gill, P.Jvanov et. al.//Nature Genetics, (1994), N 6, V. 2, P. 130-135; P.Jvanov et. al//Nature Genetics, (1996) N 12, V. 6, P. 417-425], что митохондриальная ДНК одного из индивидуумов (императора Николая II) представлена двумя митотипами. При этом один тип молекул оказался полностью идентичен контрольным объектам сравнения, а именно прямым родственникам Николая II по линии его бабки - датской королевы Луизы Гессен-Кассель; другой же тип молекул отличался по одной (единственной) позиции. Это явилось первой экспериментальной демонстрацией так называемой гетероплазмической мутации в контрольном участке митохондриальной ДНК.

Феномен гетероплазмии заключается в том, что у одного индивидуума сосуществуют в различных пропорциях новый (мутантный) и старый ("нормальный") митотипы. Возможной интерпретацией этого феномена является наличие относительно короткоживущей фазы частично фиксированной мутации - собственно гетероплазмического переходного состояния - в процессе формирования нового митотипа.

Различают гетероплазмию точковую и гетероплазмию по длине.

Например, образцы мтДНК Николая II продемонстрировали точковую С/Т-гетероплазмию в позиции L 16169 (70%С, 30%Т). В мтДНК его брата Георгия Романова позиция L 16169 также оказалась гетероплазмической, однако обнаружила "обратное" соотношение С/Т - 40%С:60%Т.

При секвенировании мтДНК гетероплазмические позиции могут дать неоднозначный результат. Поскольку в реакции участвуют два вида матриц, расшифровываемые последовательности нуклеотидов будут как бы накладываться друг на друга; там где они одинаковы, это наложение никак не проявится, однако в точке несовпадения разные "буквы" генетического кода будут выявляться одновременно. В графическом выражении это очень похоже на то, как если бы в машинописном тексте одна буква оказывается напечатанной поверх другой.

Стоит отметить, что точковые гетероплазмии встречаются достаточно редко и носят единичный характер. Поэтому при появлении неоднозначных позиций при секвенировании мтДНК следует в первую очередь поставить контрольные тесты на индивидуальную чистоту препарата ДНК, поскольку гораздо более вероятно, чем гетероплазмия, смешение в анализируемом препарате ДНК от разных лиц. Чаще всего причиной такого результата становится случайное загрязнение (контаминация) компонентов реакции ранее амплифицированными продуктами или молекулами ДНК из посторонних источников. Способность ПЦР амплифицировать даже единичные молекулы ДНК означает, что даже самые незначительные, следовые количества ДНК-контаминатов могут вовлекаться в реакцию как матричные молекулы. Это и приводит к искажению результатов. По этой причине обязателен строгий мониторинг на всех стадиях исследования индивидуальной чистоты препаратов суммарной ДНК, получаемых из объектов экспертизы.

Гетероплазмия по длине - гораздо более обычное явление. Проявляется она в том, что часть молекул, амплифицированных в индивидуальном препарате ДНК, имеет одну длину, а другая часть оказывается чуть короче (в норме - всего на один-два нуклеотида) или длиннее. Особенность этого феномена в том, что как правило, он имеет место для вполне определенных позиций в цепи мтДНК - так называемых "горячих точек". В полинуклеотидных цепях ГВС 1 и ГВС 2 таких участков известно два: это области 16184-16193 и 303-315, которые содержат тракты поли-C. В этом случае расшифровываемые последовательности нуклеотидов будут также как и при точковой гетероплазмии накладываться друг на друга, и пока они одинаковы, это наложение также никак не проявится, поскольку оно происходит "в фазе". Однако в области несовпадения между этими последовательностями возникнет фазовый сдвиг и их оставшиеся порции наложатся друг на друга уже со сдвигом. В графическом выражении это будет похоже на то, как если бы все буквы одного машинописного текста оказались напечатаны поверх букв другого текста. Такой текст прочитать очень трудно, а при сильно выраженной гетероплазмии - невозможно. Единственный способ преодолеть эту трудность - секвенировать интересующую последовательность с двух разных концов, используя в качестве матриц разные цепи ДНК.

3.6. Интерпретация результатов типирования мтДНК

Описанная в настоящем руководстве технология судебно-экспертного типирования ППАФ мтДНК, в отличие от ПДАФ-систем, основана на применении не близкородственных, а так называемых трассирующих родословных маркеров, наследуемых по материнской линии. Поэтому вопросы, поставленные на разрешение экспертизы, а также стратегия и тактика экспертного исследования и его смысловая нагрузка должны трактоваться строго в плоскости молекулярно-генетической верификации матрилинейного родства.

В этом плане достоверная нетождественность митотипов должна быть интерпретирована в общем случае как исключение происхождения сравниваемых биологических объектов от одной генетической линии и только если это обусловлено ситуационно - как исключение их происхождения от одного индивидуума.

При этом следует соблюдать следующее условие: несовпадение митотипов в исследуемых препаратах ДНК, как правило, имеет доказательственное исключающее значение только при том условии, что оно зарегистрировано в анализируемом полинуклеотидном тракте более чем в двух "нормальных" позициях. Несовпадения в потенциально гетероплазмических "горячих точках" не рассматриваются как доказательные. Это требование компенсирует возможность межтканевого полиморфизма и гетероплазмических мутаций в мтДНК.

В свою очередь, достоверная тождественность митотипов не влечет безусловный вывод о происхождении сравниваемых биологических объектов от одной генетической линии и тем более, от одного индивидуума. Здесь строго обязательна вероятностная оценка идентичности генетического происхождения объектов экспертизы при условии зарегистрированного совпадения их митотипов. Это требование диктуется необходимостью принимать во внимание возможность случайного совпадения индивидуализирующих признаков у разных лиц.

Действительно, совпадение митотипов в препаратах ДНК, полученных из биологических следов с места преступления и в ДНК подозреваемого, или же идентичность митотипов в препаратах ДНК предположительных матрилинейных родственников еще не означает, что у этих мтДНК общее происхождение. Иначе говоря, сам по себе факт митотипического совпадения не обязательно влечет за собой вывод о том, что (в зависимости от формулы экспертного задания) следы произошли именно от этого человека или его матрилинейного родственника, или же что тестируемые индивидуумы относятся к одной генетической линии. Следы могли произойти и от другого неродственного индивидуума, который неотличим по исследованным генетическим признакам от первого. Точно так же, в экспертизе родства факт совпадения митотипов еще не означает доказанной принадлежности к одной генетической линии, ибо неродственные люди в принципе могут иметь один и тот же митотип.

Это объясняется тем, что как бы ни высока была индивидуализирующая значимость анализируемых признаков-митотипов, она не абсолютна. По сути, эти признаки являются группоспецифическими, то есть каждый митотип в той или иной степени распространен в популяции. Поэтому после того как в ходе экспертизы установлен факт совпадения митотипов, характеризующих объекты экспертизы, перед экспертом встает последний и самый важный вопрос:

- Если митотипы двух препаратов ДНК совпадают, то какова вероятность того, что объекты экспертизы принадлежат к одной [материнской] генетической линии, или (только если этот вопрос ситуационно обусловлен) - произошли от одного человека?

Для того чтобы ответить на этот ключевой вопрос и, тем самым, решить экспертную задачу, необходимо прояснить два момента.

Во-первых, необходимо оценить индивидуализирующее значение выявленного комплекса признаков, то есть количественно определить насколько полученные в ходе исследования генетические признаки позволяют отграничить исследованный объект экспертизы от любого другого, ему подобного. Это так называемая раздельная оценка установленных признаков-митотипов.

Во-вторых, нужно правильно выбрать алгоритм расчета вероятности для оценки идентификационной значимости результатов экспертизы. Это - анализ совокупности экспертных данных с целью разрешения вопросов, поставленных перед экспертизой.

3.6.1. Оценка индивидуализирующего значения установленных признаков-митотипов

В качестве индивидуализирующего признака, имеющего идентификационное значение выступает целиком митотип.

Для того, чтобы определить индивидуализирующее значение установленного митотипа нужно определить его распространенность в популяции. Исходным параметром популяционных выкладок, касающихся оценки распространенности признака служит величина, называемая вероятностью признака. В нашем случае это - вероятность митотипа, которую можно обозначить символом (p). По определению эта величина равна отношению числа митотипов данной специфичности к общему числу митотипов в наблюдаемой выборке. Величину (p) называют также частотой митотипа. Ее определяют эмпирически - на основании результатов популяционных исследований.

Из этого следует, что величина (p) служит параметром, который определяет шансы любого (случайного) человека, имеющего данный митотип, считаться отпрыском именно конкретной интересующей генетической линии, которая характеризуется точно таким же митотипом.

3.6.2. Вычисление вероятности генетической идентичности объектов экспертизы

Расчет вероятности для оценки идентификационной значимости результатов экспертизы основывается на вычислении математической величины, называемой отношением правдоподобия (англ.: LR, Likelyhood Ratio). Это позволяет ответить на вопрос:

- во сколько раз более вероятно, что выявленные в ходе анализа индивидуализирующие признаки совпадают закономерно, например, когда исследуемые образцы ДНК относятся к одной материнской генетической линии (вариант - произошли от одного человека), а не случайно - то есть, когда они принадлежат к двум разным генетическим линиям (или двум неродственным членам популяции).

    В количественном выражении:                    LR = 1/p

Однако, строго говоря, вычисление LR не дает ответа на главный вопрос, призванный количественно охарактеризовать доказательственное значение экспертизы, а именно:

- если совпадение признаков установлено, то какова вероятность того, что это совпадение закономерно, а не произошло по воле случайности?

Ответить на этот вопрос можно, используя формулу вычисления условной вероятности, выведенную Байесом (Bayes). Общий смысл этой формулы в том, что зная так называемую априорную ("до опыта") вероятность интересующего нас некоего события, (например, происхождения ДНК от этого, или же от другого человека) мы можем определить величину постериорной ("после опыта") вероятности этого же события при условии, что уже произошло другое событие, имеющее определенное отношение к первому (например, митотип идентифицирующего объекта и митотип идентифицируемого человека совпали).

Априорную вероятность в общем случае принято считать равной 0,5. (Надо подчеркнуть, что хотя эта величина и не является бесспорной, изменение оценки априорной вероятности не входит в компетенцию эксперта и является прерогативой суда). Можно показать, что подставляя это и другие соответствующие рассматриваемому случаю значения величин в формулу Байеса, мы получим выражение, определяющее конечную постериорную вероятность того, что при наблюдаемом совпадении митотипов исследованные образцы мтДНК имеют генетически общее происхождение. Эту байесову вероятность генетической общности происхождения объектов типирования можно обозначить буквой P.

В количественном выражении:

                              P = 1/(1 + LR)

Эту вероятность можно выразить в процентах: P x 100 = %.

ПРИМЕЧАНИЕ. Строго говоря, подобный расчет приемлем только в том случае, если общность происхождения генетического материала в объектах экспертизы не исключается другими методами.

3.7. Эффективность использования метода и показания к применению

С точки зрения задач судебно-медицинской экспертизы использование анализа ППАФ мтДНК эффективно в двух случаях: это идентификация личности и установление биологического родства. Речь может идти об идентификационных исследованиях при расследовании убийств, тяжких телесных повреждений, изнасилований и других преступлений против личности, требующих судебно-медицинского исследования вещественных доказательств, а также при опознании расчлененных, сильно деформированных, обгоревших трупов - в случае массовых катастроф, взрывов, землетрясений и военных конфликтов.

Особая ценность данного методического подхода обусловлена тем обстоятельством, что в перечисленных случаях для экспертизы могут быть недоступны идентифицирующие объекты, которые позволили бы прямо установить индивидуализирующие признаки погибших на уровне их хромосомной ДНК. Поэтому остается только возможность непрямой идентификации, например, путем использования в качестве идентифицирующих объектов биологических образцов от родственников устанавливаемых лиц. Однако, в этих условиях решение судебно-медицинской задачи идентификации с помощыо только стандартного молекулярно-генетического анализа хромосомных маркеров представляет серьезные трудности, поскольку речь может идти о достаточно отдаленном родстве или о более вариантных принципах наследования ядерных генов-признаков. По этой причине, как было показано ранее П.Ивановым и сотр. [P.L.Ivanov et. al.//Fingerprint News (Cambridge, UK), 1992, vol. 4(3), P. 11-15.], во всех этих случаях - когда генетическая дистанция, разделяющая родственников по вертикали, превышает одно поколение, или в случае горизонтальных схем, - верификация родственных связей с помощью анализа одной лишь хромосомной ДНК оказывается проблематичной.

Между тем, описанная в настоящем руководстве технология типирования ППАФ мтДЦК является по существу методом молекулярно-генетической верификации родственных связей с помощыо применения не близкородственных, а так называемых трассирующих родословных маркеров. Именно поэтому в описанных сложных случаях оказывается выше специфичность признака-маркера, а значит, и его избирательность, то есть способность выделять конкретный объект среди других, даже сходных по другим признакам.

В целом, идентификационная значимость признаков, определяемых на уровне мтДНК достаточно высока, и использование этой индивидуализирующей системы в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления родства потенциально обеспечивает высокий уровень доказательности.

4

Утверждаю
Заместитель Министра
здравоохранения
Российской Федерации
А.И.ВЯЛКОВ
19 января 1999 года
 
Согласовано
Руководитель Департамента
научно-исследовательских
и образовательных
медицинских учреждений
В.И.СЕРГИЕНКО
18 января 1999 года
 
Руководитель Департамента
организации медицинской
помощи населению
А.А.КАРПЕЕВ
11 января 1999 года
 
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ
ПОЛИМОРФИЗМА ДЛИНЫ АМПЛИФИЦИРОВАННЫХ ФРАГМЕНТОВ (ПДАФ) ДНК
В СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЕ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛИЧНОСТИ
И УСТАНОВЛЕНИЯ РОДСТВА
 
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
N 98/253
 
Методические указания посвящены регламентированию в рамках экспертного подхода методических и аналитических процедур, сопряженных с анализом полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) в аллельных профилях гипервариабельных локусов хромосомной ДНК человека, а также общей методологии использования индивидуализирующих ПДАФ-систем при решении задач судебно-медицинской экспертизы. Обобщен и проанализирован накопленный практический опыт, касающийся производства судебно-медицинской экспертизы (исследования) вещественных доказательств с помощью применения методов молекулярно-генетической индивидуализации человека, и в частности - методов идентификации личности и определения биологического родства, основанных на использовании феномена ПДАФ.
Настоящие Методические указания касаются общих принципов экспертного использования молекулярно-генетических индивидуализирующих систем на основе феномена ПДАФ. Для более детальной проработки конкретных вопросов практического применения метода следует обратиться к другим нормативным, инструктивным и методическим документам, регламентирующим производство экспертиз в Российской Федерации, в частности, к "Правилам производства судебно-медицинской экспертизы (исследования) вещественных доказательств с помощью применения методов молекулярно-генетической индивидуализации человека" (РЦСМЭ МЗ РФ, 1998), "Стандартным операционным процедурам" (РЦСМЭ МЗ РФ, 1998) и др.
Методические указания подготовлены зав. отделом судебно-медицинских генетических научных и экспертных исследований Республиканского центра судебно-медицинской экспертизы доктором биологических наук Ивановым П.Л.
 
Введение
 
Существует несколько базовых технологий молекулярно-генетического (геномного) идентификационного анализа, применяемых в судебно-медицинской экспертной практике. Общим для них является исследование особых, так называемых гипервариабельных участков геномной ДНК человека, которые строго специфичны для каждого индивидуума и потому могут служить индивидуализирующими личность признаками.
Вариант молекулярно-генетического идентификационного анализа, в основе которого лежит феномен полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК, является одним из наиболее перспективных в плане судебно-медицинского исследования вещественных доказательств. Он отличается высокой дифференцирующей способностью - благодаря использованию в качестве маркерных (диагностических) элементов высокополиморфных генетических локусов мини- и микросателлитной природы, а также чрезвычайно высокой чувствительностью - благодаря применению процесса энзиматической амплификации молекул ДНК, известному как полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Феномен ПДАФ проявляется в том, что в случае ПЦР-амплификации гипервариабельных мини- и микросателлитных генетических матриц (локусов), присутствующих в геноме каждого человека, в ходе реакции образуются фрагменты ДНК, которые у разных людей имеют разную длину - и потому оказываются индивидуально специфичными. Эти полиморфные по длине фрагменты, по сути представляющие разные аллельные варианты полиморфных локусов геномной ДНК, становятся доступными для сравнительного анализа в качестве индивидуализирующих личность признаков. Важно отметить, что в ряду поколений каждый вариант ПДАФ наследуется как простой менделевский кодоминантный признак. Все это создает прекрасные предпосылки для решения экспертных задач, связанных как с индивидуализацией и идентификацией, так и с установлением биологических родственных связей данного индивидуума с другими лицами (например, установление фактов отцовства или материнства).
ПДАФ-типирование ДНК является одним из наиболее доказательных методов анализа биологического материала при производстве судебно-медицинской идентификационной экспертизы. В то же время, следует подчеркнуть, что экспертные исследования биологических объектов с использованием индивидуализирующих систем ПДАФ-типа предъявляют очень высокие требования как к техническому обеспечению анализа, так и к степени корректности экспериментальных процедур и интерпретационных построений. Наряду с бесспорными преимуществами по сравнению с традиционными методами, экспертное применение анализа ПДАФ в судебно-медицинской практике сопряжено с целым рядом осложняющих моментов. Технология анализа включает многостадийные операции и многопараметрические процессы, которые таят в себе опасность различного рода артефактов. Интерпретация получаемых в ходе исследования данных часто достаточно сложна и требует детального анализа с позиции молекулярной биологии и популяционной генетики. Учитывая же характерное для данного вида экспертизы высокое доказательственное значение выводов, возможная неадекватность экспериментальных процедур и неправильное истолкование результата чреваты серьезными экспертными и, как результат, судебно-следственными ошибками.
Из всего сказанного очевидно, что для обеспечения надлежащего уровня надежности и доказательности необходима строгая методическая регламентация судебно-медицинских экспертиз вещественных доказательств, проводимых с помощью применения методов молекулярно-генетической индивидуализации человека. В рамках этой задачи в настоящих Методических указаниях изложены общие принципы экспертного использования молекулярно-генетических индивидуализирующих систем на основе феномена ПДАФ для целей идентификации личности и разрешения вопросов спорного происхождения детей. Рассмотрены принципиальные вопросы, касающиеся специфики лабораторных процедур и интерпретации экспертных данных, а также методические приемы, призванные повысить надежность анализа.
 
Описание метода
 
1. Формула метода
 
Предложен метод судебно-медицинской экспертизы (исследования) вещественных доказательств биологической природы, основанный на молекулярно-генетической индивидуализации человека. Принцип метода заключается в использовании индивидуализирующих систем на основе полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) хромосомной ДНК.
В общем виде метод предусматривает выделение из исследуемых объектов хромосомной ДНК, энзиматическую амплификацию с помощью ПЦР мини- и микросателлитных локусов этой ДНК, которые в силу своей природы обладают свойством индивидуальной специфичности, и сопоставление полученных индивидуальных картин распределения по длине амплифицированных фрагментов ДНК (так называемых амплификационных профилей) с целью их отождествления или выявления сходства и различий и установления на этом основании определенных фактов в плане судебно-медицинской идентификации личности и определения биологического родства.
 
2. Материально-техническое обеспечение метода
 
2.1. Требования к помещениям
 
Судебно-медицинская экспертиза вещественных доказательств с помощью применения индивидуализирующих систем ПДАФ-типа должна проводиться только в специализированной лаборатории бюро судебно-медицинской экспертизы, удовлетворяющей требованиям "Положения о лаборатории молекулярно-генетических исследований бюро судебно-медицинской экспертизы" (приложение к Приказу Минздрава РФ N 131 от 22.04.98 "О мерах по совершенствованию судебно-медицинской службы в Российской Федерации").
Главным требованием является обеспечение и строгое соблюдение принципа компартментализации основных стадий производственного процесса. Это означает, что в лаборатории должны быть выделены территориально автономные операционные зоны (компартменты), каждая из которых предназначена для выполнения строго определенного круга операций. Каждая зона должна быть укомплектована спецодеждой, лабораторным и офисным оборудованием, посудой, которые предназначены для использования только в границах данной зоны. Таких зон минимум три:
а) лабораторная зона общего назначения: помещения для хранения и препарирования вещественных доказательств, забора крови, выделения и очистки ДНК, мойки и стерилизации посуды; к этой зоне относятся кабинеты экспертов, лаборантские и санитарские помещения, компьютерный зал для обработки данных и оформления документов, аппаратные;
б) чистая зона ПЦР: стерильные, оборудованные УФ-облучателями боксированные помещения с приточно-нагнетательной вентиляцией - для приготовления реагентов, компонентов реакционных смесей, для пробоподготовки и постановки ПЦР;
в) зона для анализа продуктов амплификации: оборудованные УФ-облучателями боксированные помещения с вытяжной вентиляцией - для проведения электрофореза ДНК, окрашивания гелей и документирования электрофореграмм.
Компартментализация рабочего процесса, связанного с применением ПЦР, служит абсолютно необходимой мерой предосторожности, которая позволяет свести к минимуму риск случайных загрязнений компонентов реакции ранее амплифицированными продуктами или молекулами ДНК из посторонних источников. Способность ПЦР амплифицировать единичные молекулы ДНК означает, что опасность представляют даже самые незначительные, следовые количества ДНК-контаминантов, которые могут вовлекаться в реакцию как матричные молекулы. Это приводит к искажению результатов исследования.
 
2.2. Необходимое оборудование
 
В соответствии с процедурой метода на первом этапе осуществляется выделение из исследуемых объектов геномной ДНК, ее очистка, определение концентрации и хранение. Для этого необходимо типовое лабораторное оборудование для молекулярной биологии (в том числе: вытяжной шкаф, мини- и микроцентрифуга, суховоздушный и водяной термостаты, рн-метр, аквадистиллятор-деионизатор, спектрофотометр, аналитические весы, микропипетки-дозаторы, лабораторная посуда, холодильник/морозильник).
Постановка ПЦР требует наличия стерильного шкафа-бокса с ультрафиолетовым облучателем, а также термоциклера (ДНК-амплификатора). Эти позиции выпускаются серийно отечественными и зарубежными производителями.
На этапе электрофоретического фракционирования ДНК необходимы стандартные аппараты для электрофореза в гелях агарозы и полиакриламида (соответственно, горизонтальные и вертикальные), микроволновая печь, стандартные источники тока для электрофореза - низковольтный (300 в/250 mA) и высоковольтный (1000 в/300 mA), УФ-трансиллюминатор, снабженный системой документирования изображения (напр. фото- или видеокамерой) или/и прибор для вакуумной сушки гелей.
Для анализа результатов исследования и обработки экспертных данных требуется набор стандартной офисной оргтехники (компьютер с периферийными устройствами: принтер, сканер и проч.).
 
3. Технология использования метода
 
Технологическая схема выполнения экспертизы вещественных доказательств с использованием ПДАФ-систем включает следующие этапы:
а) получение препаратов хромосомной ДНК из объектов исследования;
б) энзиматическая ПЦР-амплификация на матрице этой ДНК специфических участков, обладающих свойством ПДАФ с целью их последующего генотипирования (определения геномных вариантов);
в) фрагментный анализ: фракционирование с помощью гель-электрофореза продуктов амплификации, сопоставление амплификационных профилей, определение молекулярных размеров фрагментов и их генотипирование;
г) интерпретация результатов: раздельная оценка выявленных геномных признаков и определение их индивидуализирующего значения, сопоставление и оценка различия и совпадения комплекса признаков, анализ всей совокупности экспертных данных с целью разрешения вопросов, поставленных перед экспертизой.
 
3.1. Получение препаратов ДНК
 
Предметом судебно-медицинских молекулярно-генетических экспертных исследований являются следы и иные вещественные доказательства по делу - объекты биологического происхождения от трупов и живых лиц. Хромосомная ДНК содержится во всех ядерных клетках организма, поэтому для экспертного исследования в принципе пригодны любые биологические субстраты, в которых сохранились хотя бы единичные ядерные клетки или остатки их ядерного материала: мягкие ткани, жидкая кровь и выделения, высохшие следы крови и выделений, зубы и волосы человека, отчлененные части тела и фрагменты частей тела от неопознанных и расчлененных трупов, фрагменты скелетированных трупов, отдельные кости, костные фрагменты и др. При этом важно подчеркнуть, что во всех клетках одного организма ДНК одинакова. Это позволяет проводить отождествление объектов на основании сравнительного ПДАФ-анализа биологических образцов разного тканевого происхождения.
С точки зрения экспертного использования, среди множества известных методик выделения и очистки ДНК наибольшее значение имеет классическая фенол-хлороформная экстракция, которая универсальна, обладает хорошей воспроизводимостью и способна обеспечить высокую степень чистоты ДНК; полученные этим методом препараты стабильны и могут храниться при +4 °С в течение нескольких лет. Поэтому методикам выделения ДНК, основанным на органической экстракции, следует отдать предпочтение.
В общем случае, это многоэтапные процедуры, которые предусматривают разрушение (лизис) клеточных структур и диссоциацию хромосомных нуклеопротеидных комплексов с помощью применения детергентов, протеазную обработку лизата, экстрагирование белков органическими растворителями, отделение водной фазы, содержащей ДНК, и концентрирование и очистку ДНК путем спиртовой преципитации или ультрамикрофильтрации.
Существуют также методики, которые без применения органических растворителей позволяют получать пригодные для анализа в ПЦР препараты ДНК. Большинство из них являются вариантами вышеприведенной схемы, но позволяют экономить время и не прибегать к трудоемкой процедуре фенольной экстракции. Однако эти процедуры применимы лишь для некоторых видов объектов. Наиболее распространенным универсальным неорганическим методом, пригодным для экспертного применения, является метод с использованием хелатирующего реагента "Килекс" (Chelex(R) 100). Это экспресс-метод, который вообще не предполагает выделения ДНК в очищенном виде; получаемый препарат по сути представляет клеточный лизат, который содержит все исходные компоненты, только в инактивированной форме. Этот метод прост и не требует много времени. Нужно однако учитывать, что его надежность, а также качество и стабильность "килексных" препаратов в целом заметно ниже, чем фенол-хлороформных экстрактов.
Очень важный в экспертной практике частный случай - это получение ДНК из спермы и смешанных следов, содержащих сперму. Особенность здесь в том, что хроматин сперматозоидов имеет принципиальное отличие от хроматина соматических клеток - его структура дополнительно стабилизирована дисульфидными связями. Поэтому применяемый по стандартной процедуре выделения ДНК протеолиз в случае спермального хроматина малоэффективен и идет очень медленно, а используемые для диссоциации нуклеопротеинов детергенты практически не оказывают на него солюбилизирующего действия. В результате выход спермальной ДНК оказывается практически нулевым. Для преодоления этой трудности при выделении ДНК из спермы в клеточный лизат вводят дополнительно реагенты-тиовосстановители, например дитиотрейтол или 2-меркаптоэтанол, которые разрушают дисульфидные белковые сшивки. Это позволяет продолжить процесс по стандартной схеме.
На использовании описанной особенности спермального хроматина основан общепринятый метод селективного выделения ДНК сперматозоидов из смешанных следов, содержащих сперму. Это двухэтапная процедура, получившая название дифференциального лизиса клеток. Суть ее заключается в том, что при выделении ДНК из смеси сперматозоидов и соматических клеток на первом этапе, представляющем собой стандартный протеазно-детергентный лизис, солюбилизируется только хроматин соматических клеток. Его раствор отделяют центрифугированием от остающегося структурированным (и потому нерастворимым) спермального хроматина и используют для экстрагирования соматической ДНК. Отделенный же спермальный хроматин подвергают второму литическому циклу, но уже с добавлением реагентов-тиовосстановителей, и уже потом из получившегося лизата экстрагируют спермальную ДНК.
Следует особо подчеркнуть, что при проведении судебно-медицинского исследования следов, содержащих сперму, для дифференцирования присутствующих в смеси генетического материала мужчины - донора спермы и ДНК из других возможных источников (например, эпителиальных клеток и клеток крови потерпевших при изнасиловании), в обязательном порядке должны применяться только такие методики, которые включают двухэтапный дифференциальный лизис клеток с использованием на втором этапе реагентов-тиовосстановителей.
Типовые варианты методик получения препаратов ДНК из объектов экспертизы - как с использованием органической экстракции, так и в виде "килексных" лизатов, приведены в сборнике "Стандартные операционные процедуры" (РЦСМЭ МЗ РФ, 1998 г.).
 
3.2. ПЦР-амплификация полиморфных локусов
на матрице геномной ДНК
 
При постановке ПЦР геномную ДНК, обычно в количестве 2 - 200 нг, вводят в реакционную смесь, содержащую все необходимые компоненты для работы фермента - термостабильной ДНК-полимеразы (обычно Taq полимеразы в количестве 1 - 3 е.а.). Там хромосомная ДНК будет служить субстратом-матрицей для амплификации нужного локуса. Специфическим компонентом реакции и амплификационной индивидуализирующей системы в целом являются олигонуклеотидные (15 - 30 звеньев) праймеры - именно они определяют, какой генетический локус будет избирательно нарабатываться в ходе реакции. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез новых полинуклеотидных цепей с помощью ДНК-полимеразы осуществляется только между ними, удваивая в каждом цикле количество копий этого участка ДНК. Для проведения полимеразной цепной реакции, кроме исходного препарата ДНК, праймеров (в концентрации 0,1 - 1 мкМ), Taq полимеразы, нужны еще так называемые предшественники ДНК - дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дезоксинуклеотиды) в концентрации 200 мкМ и солевой буферный раствор. Эти компоненты смешивают в реакционной пробирке в микрообъеме (обычно 25 - 100 мкл) и помещают в специальный прибор - программируемый термоциклер (ДНК-амплификатор), который обеспечивает необходимый температурный профиль реакции: она претерпевает 25 - 35 циклов нагрева и охлаждения в интервале температур от 50 до 95 °С.
Параметры температурного профиля - продолжительность и температуpa каждой стадии полимеразной реакции зависят от структуры используемых праймеров и потому индивидуальны для каждой конкретной амплификационной индивидуализирующей системы.
Весь процесс длится несколько часов. За время процесса интересующие последовательности ДНК, присутствующие в исходной геномной матрице, многократно (миллионократно) копируются ферментом Taq полимеразой, и эти молекулярные копии накапливаются в реакционной смеси.
Амплифицируемые в ходе ПЦР мини- и микросателлитные участки (локусы) ДНК - это относительно короткие нуклеотидные последовательности, организованные в виде блоков тандемных повторов. Высокий уровень вариабельности (феномен гиперполиморфизма) микро- и минисателлитов основан на том, что число тандемных повторов, соединенных "голова к хвосту" в единую последовательность ДНК непостоянно и варьируется в разных аллелях данного локуса от одного до нескольких десятков. Таким образом, для данного локуса в популяции обнаруживается целый набор аллелей (феномен мультиаллельности), отличающихся друг от друга по числу повторяющихся единиц. У каждого индивидуума в популяции имеется из этого набора по 2 аллеля, и они могут быть равной или разной длины (соответственно гомозиготное и гетерозиготное состояния). Такого рода генетические элементы получили название локусов с вариирующимся числом тандемных повторов или просто тандемных повторов с переменным числом звеньев.
В методическом плане важно отметить, что класс тандемных полиморфных локусов условно разбит на два подкласса: минисателлитов или VNTR (англ. - Variable Number Tandem Repeat) - с длиной повтора более семи пар нуклеотидов и микросателлитов, у которых длина повторяющейся единицы составляет от одного до семи пар нуклеотидов и которые еще называют короткими тандемными повторами или STR (англ. - short tandem repeat). Эти две группы ПДАФ-систем, хотя и являются функциональными аналогами, не вполне эквивалентны по своим прикладным свойствам; в аспекте судебно-медицинской экспертизы их следует рассматривать как взаимнодополняющие. Суть их особенностей в следующем.
Минисателлитные системы в своем большинстве обладают гораздо более высоким полиморфизмом, чем микросателлитные. Соответственно, их дифференцирующие свойства также заметно выше. Однако существенные ограничения накладываются на ПДАФ-анализ минисателлитных локусов при исследовании деградированных препаратов ДНК, например выделенных из пятен крови, спермы, слюны, а также частей волосяного покрова и трупного материала, подвергшихся разложению под действием разрушающих биологических или физико-химических факторов. При анализе подобных препаратов может наблюдаться отсутствие электрофоретических полос в аллельном диапазоне, что, как правило, свидетельствует о деградации аллелей анализируемого локуса. Если же при анализе деградированного образца ДНК обнаруживается только один низкомолекулярный аллель, то в этом случае существует опасность ложной гомозиготности: возможно, анализируемый образец является гетерозиготным, но высокомолекулярный аллель не выявляется в ходе исследования, поскольку степень его деградации оказывается более высокой.
С этой точки зрения ПДАФ-типирование микросателлитных, STR-локусов может дать определенные преимущества. Так, благодаря более коротким по сравнению с минисателлитными размерам STR-аллелей, в целом выше вероятность их сохранения в деградированной ДНК. На практике это означает ощутимый выигрыш в чувствительности анализа. Кроме того, вероятность ложной гомозиготности, обусловленной предпочтительной амплификацией низкомолекулярных аллелей, крайне низка для микросателлитных локусов вследствие узости спектра аллельных длин.
В настоящее время для экспертных целей разработано несколько десятков молекулярно-генетических ПДАФ-систем на основе мини- и микросателлитных полиморфных локусов. Следует иметь в виду, что в случае микросателлитов согласно международной практике для экспертного применения подходят только "крупные" - тетра- и пентануклеотидные STR.
 
3.3. Фрагментный анализ. Позиционное сопоставление
амплификационных геномных профилей
 
Гипервариабельные тандемно организованные локусы содержат различное число повторяющихся элементарных звеньев-повторов. При амплификации с праймерами, расположенными на флангах такого локуса, образуются фрагменты ДНК различной длины, причем длина фрагмента будет пропорциональна числу повторов. Таким образом, в данной аналитической системе любой индивидуальный образец ДНК человека характеризуется наличием двух амплифицированных фрагментов разной или одинаковой длины (соответственно, гетерозиготное и гомозиготное состояние), поскольку каждая из двух гомологичных хромосом несет свой вариант гипервариабельного локуса, и эти варианты могут отличаться числом содержащихся в них тандемных повторов.
Синтезированные в ходе ПЦР продукты - молекулярные копии полиморфных участков геномной ДНК накапливаются в реакционной смеси, вследствие чего количественно оказываются доступными для сравнительного анализа. Для этого полученные амплификационные продукты фракционируют по длине с помощью электрофореза в геле агарозы или полиакриламида (в последнем случае применяют как обычный электрофорез, так и электрофорез в денатурирующих условиях) и фрагменты ДНК, амплифицированные в ходе реакции, выявляют, используя различные методы детекции. Чаще всего на электрофореграмме визуализируют полосы (зоны локализации фрагментов ДНК одного размера) с помощью флуоресцентного красителя этидиумбромида и затем регистрируют фотографически в УФ-свете или путем окрашивания нитратом серебра (в акриламидных гелях) с последующей фиксацией и высушиванием геля.
Индивидуальность ДНК реализуется в виде индивидуально-специфичной комбинации из двух полиморфных фрагментов (полос на электрофореграмме), характеризующихся определенным расположением на дорожке геля. Это так называемый амплификационный профиль ДНК, который и является в данном случае индивидуализирующей геномной характеристикой человека, которому принадлежит анализируемая ДНК. Для целей отождествления амплификационных профилей ДНК или выявления в них признаков сходства и различий проводят их позиционное сопоставление.
При анализе электрофореграммы можно выделить два аспекта:
а) картины распределения полос на сравниваемых дорожках геля похожи или непохожи;
б) позиции соответствующих фрагментов совпадают или не совпадают.
Вопрос о том, одинаковы или неодинаковы амплификационные профили, полученные при анализе препаратов ДНК, выделенных из объектов экспертизы (скажем, из биологических следов на вещественных доказательствах и из крови проходящих по делу лиц), является в экспертизе ключевым. Это ясно, поскольку от того, как будет интерпретирован результат сравнения, зависит экспертный вывод: в одном случае это не исключение, а в другом - исключение причастности данного лица к происхождению следов. Между тем, именно вопрос о похожести и непохожести геномных профилей таит в себе большую опасность неверного решения из-за множества имеющихся здесь подводных камней. Некоторые из них мы и рассмотрим в этом разделе.
3.3.1. Ложное генотипирование
Что касается общей похожести одного геномного профиля на другой, то здесь ложный результат может быть обусловлен двумя причинами. Во-первых, присутствие в сравниваемых препаратах ДНК постороннего генетического материала (чаще всего - в результате случайных загрязненений) может имитировать как совпадение, так и различие их геномных профилей. Во-вторых, этот же эффект может проявиться как результат неправильного генотипирования, в частности - ложноопределенной гомо- или гетерозиготности анализируемых объектов. Это связано с артефактами полимеразной цепной реакции, возникающими под влиянием неоптимальных условий ее проведения:
- избыточным или недостаточным исходным количеством матричной ДНК;
- плохим качеством препарата;
- неспецифичностью праймеров и (или) неадекватно подобранным для них рабочим режимом, например, отжигом при более низкой, чем следует, температуре;
- неоптимальной концентрацией Taq полимеразы в реакционной смеси, в частности, ее избыточным количеством;
                                                                2+
    - присутствием в реакции неоптимальной концентрации ионов Mg  ;
- профилем кривой нагрева реакционной смеси с неоптимальными значениями температурных переходов (это может быть вызвано неудачными техническими параметрами прибора, используемого для амплификации ДНК);
- неоптимальной продолжительностью процесса циклического наращивания.
Наиболее распространенный артефакт - так называемый феномен предпочтительной амплификации аллелей довольно часто приводит к ошибочному заключению о гомозиготности. Вместе с тем, наряду с опасностью типирования ложных гомозигот нередки и более сложные случаи искажения генотипа, характеризующиеся не только частичной утратой истинных аллелей, но амплификацией неспецифических (неаллельных) фрагментов, имитирующих ложно-гетерозиготный аллельный профиль. Решить проблему ложноопределенной гомо- или гетерозиготности в некоторых случаях бывает весьма непросто. Помочь здесь может анализ устойчивости амплификационных профилей, основанный на амплификационном титровании сомнительных препаратов, использовании разных условий электрофореза и сред разделения, а также многократная проверка воспроизводимости результата.
3.3.2. Сдвиг полос
Второй аспект вопроса - физическое сопоставление полос на электрофореграмме - также требует учета многих факторов. Одна из неприятностей здесь - так называемый сдвиг полос, когда в процессе электрофореза фрагменты ДНК в одной дорожке геля движутся быстрее или медленнее, чем идентичные фрагменты в соседней дорожке. Это явление имеет несколько причин:
- неодинаковое количество ДНК в разных дорожках геля;
- неодинаковые ионные условия в препаратах, внесенных в разные дорожки геля (присутствие в препаратах примесей, влияющих на электрофоретическую подвижность ДНК - солей, спирта, фенола этидиумбромида и др.);
- избыточная напряженность электрического поля;
- перегрев и нарушение структуры геля (избыточный ток);
- истощение электрофореэного буфера;
- микрогетерогенность геля (в частности, недостаточно высокое качество среды разделения).
Большая часть перечисленных факторов поддается контролю, поэтому решением проблемы может быть оптимизация и текущий мониторинг соответствующих параметров.
В некоторых случаях сдвиг полос носит не ступенчатый, а сглаженный характер (например, хорошо известный эффект "улыбки"). Тогда возникающие геометрические искажения электрофоретической картины в принципе поддаются математическому анализу и могут быть скомпенсированы на стадии обработки изображения. Для этого рекомендуется кроме фланкирующих дорожек также и каждую третью-четвертую дорожку геля делать референтной, то есть вносить в нее маркеры молекулярных масс, по которым будет рассчитываться фактор коррекции. Следует однако сказать, что надежная математическая коррекция возможна не всегда и электрофорез по возможности следует повторить.
3.3.3. Разрешающая способность электрофореза
Еще один очень важный момент, о котором следует помнить при позиционном сопоставлении полос на электрофореграмме - это разрешающая способность используемой электрофоретической системы. Оценка этого параметра имеет принципиальное значение для решения вопроса о самой возможности адекватного сравнения амплификационных профилей. Для того, чтобы иметь такую возможность, необходимо быть уверенным, что применяемая для фракционирования амплифицированных фрагментов ДНК аналитическая система позволяет уверенно различать аллельные варианты, отличающиеся по длине как минимум на одно повторяющееся звено. Иначе, можно ошибочно посчитать идентичными те фрагменты, которые имеют близкую, но не одинаковую длину.
Для разделения аллелей применяемых на практике локусов с вариирующимся числом тандемных повторов, таких как STR-локусов (длина повторяющейся последовательности 2 - 4 п.н.) и VNTR-локусов с коротким шагом (в частности, минисателлитного локуса D1S80, где длина повторяющейся последовательности составляет 16 п.н.), необходимо иметь возможность различать фрагменты ДНК, которые отличаются по длине на 1 - 2% (и даже меньше в случае коротких тандемных повторов). Это справедливо и в случае электрофоретического фракционирования половых гетероформ амелогенинового гена, где надежность разделения дублета XY (106/112 п.н.) имеет принципиальное значение для использования данного теста.
Обеспечить такое разрешение способна не всякая электрофоретическая система. В первую очередь этим обусловлены высокие требования, предъявляемые к электрофоретическим средам разделения. В современном анализе ДНК применяются агарозные и полиакриламидные гели.
Если говорить об агарозных гелях, то они безусловно являются наиболее удобными и технологичными системами для электрофоретического анализа ДНК: с ними легко манипулировать и они не обладают присущим акриламиду нейротоксическим действием. Кроме того, стандартные нативные гели агарозы в гораздо меньшей степени, чем полиакриламидные среды, чувствительны к случайным флуктуациям в макроструктуре молекул ДНК и потому менее склонны к определенным, связанным с этим артефактам, которые могут приводить к позиционным искажениям в анализируемом геномном профиле и как следствие - к ошибкам при идентификации аллелей. Однако следует помнить, что разделяющая способность обычных агарозных гелей в отношении фрагментов ДНК малого размера намного ниже, чем у полиакриламидных, и потому они непригодны для фрагментного анализа STR-локусов и даже некоторых VNTR-локусов с коротким шагом. В этих случаях следует использовать специальные агарозные среды, такие как модифицированные агарозы семейства NuSieve(R) и MetaPhor(R) фирмы FMC Bio Products (США) или аналогичные им продукты других фирм.
Акриламидные гели могут применяться как нативные, так и денатурирующие. Каждая из этих систем имеет ряд особенностей. Из принципиальных моментов отметим, что интерпретация электрофореграмм, полученных в денатурирующих условиях, может осложняться эффектом "разделения цепей", когда индивидуальные фрагменты ДНК в геле оказываются представленными двумя полосами. Что касается нативных полиакриламидных гелей, то в целом это системы с нехарактерными для агарозы электрофоретическими свойствами: они гораздо более чувствительны к пространствено-конформационным параметрам молекул ДНК. Поэтому в этих гелях электрофоретическое поведение фрагментов ДНК довольно сильно зависит от их нуклеотидного состава, что может проявляться в так называемом эффекте аномальной электрофоретической подвижности и вызывать определенные геометрические искажения амплификационного профиля, в частности - позиционные несоответствия, касающиеся наблюдаемых и реальных размеров фрагментов.
На практике разрешение электрофореза нужно обязательно контролировать, например, визуально - используя наборы локус-специфичных аллельных маркеров (аллельных "лестниц"), или с помощью компьютерных программных средств, используя внутренние или внешние маркеры молекулярных масс.
3.3.4. Измерение электрофоретической подвижности фрагментов ДНК
Из сказанного выше очевидно, что вопрос позиционного совпадения или несовпадения амплифицированных фрагментов ДНК в сравниваемых геномных профилях (по сути - вопрос их тождественности или отличия) не может быть адекватно решен "на глазок". И прежде всего потому, что при таком способе оценки трудно учесть все действующие факторы в их совокупности, а именно это влияет на результат. Так например, при невысоком электрофоретическом разрешении можно ошибочно отождествить заведомо разные фрагменты, поскольку их позиции совпадут на электрофореграмме. В более сложных случаях, в сочетании с выраженным эффектом сдвига полос, недостаточное разрешение электрофореза может привести к тому, что наоборот, заведомо одинаковые фрагменты будут иметь разные позиции на геле и восприниматься как разные аллели.
Поэтому, строго говоря, вопрос позиционного совпадения или несовпадения фрагментов ДНК должен решаться аналитическим путем - на том основании, что позиции сравниваемых фрагментов попадают или же не попадают в интервалы, удовлетворяющие установленным допускам. Очевидно, что такой подход в первую очередь требует выполнения физических измерений на электрофореграмме и учета их неизбежных неточностей.
Существует множество методов, позволяющих проводить измерение электрофоретической подвижности фрагментов ДНК на геле. При этом определенные ограничения на применимость того или иного метода накладывают погрешности измерений.
Так, наиболее простой, но и наименее точный способ - измерение обычной линейкой. Однако он оказывается неприемлемым для относительно коротких агарозных гелей, когда цена деления мерной шкалы легко "вмещает" разницу в подвижности двух соседних аллелей. Более или менее универсальный вариант - это так называемый дигитайзер (англ. digitizer), представляющий собой электронный модуль, включающий курсор-измеритель и цифровое координатное устройство. Такой модуль может использоваться как самостоятельный прибор или в качестве составной части компьютерных систем обработки изображения. Наивысшую надежность и точность измерений обеспечивают компьютеризованные регистрирующие системы, снабженные соответствующими программными средствами.
В качестве примера можно рекомендовать компьютеризованную систему TVID-DATAPHOR, разработанную и внедренную в 1993 г. в Бюро Главной судебно-медицинской экспертизы МЗ РФ. При помощи видеокамеры данная система позволяет получать и хранить в памяти компьютера оцифрованное изображение окрашенного геля. Программные средства позволяют эксперту осуществить контроль электрофоретического разрешения, провести анализ распределения материала в полосе на электрофореграмме и двумерное измерение пробега в геле, а затем определить размеры фрагментов ДНК с использованием нескольких алгоритмов. Предусмотрена также возможность коррекции электрофоретической неоднородности геля. Программа-дигитайзер имеет координатную систему с ценой деления в 1 пиксель, что обеспечивает точность измерений в реальном масштабе в пределах +/- 0,1 мм.
3.3.5. Позиционные критерии сопоставления геномных профилей
В плане решения ключевого вопроса - позиционного совпадения или несовпадения фрагментов ДНК, оценка величины физической погрешности, используемой экспертом аналитической системы, позволяет установить для данной системы соответствующие объективные правила позиционного сопоставления амплификационных профилей.
Рассуждая чисто теоретически, обобщенные требования для аналитической системы просты, а именно: позиции на геле разных аллельных фрагментов не должны совпадать, а одинаковых - различаться. Однако не следует забывать, что физическая погрешность используемых на практике аналитических систем - реальная величина, и потому позиции идентичных фрагментов на геле могут несколько различаться. Это может привести к неоднозначному истолкованию результата. Чтобы избежать интерпретационных ошибок, надо руководствоваться следующими критериями оценки:
- два фрагмента ДНК считать тождественными друг другу - если их позиции на геле не отличаются более чем на удвоенную величину физической погрешности системы при условии, что разрешение электрофореза в этой точке достаточно, чтобы величина физической погрешности была меньше 1/4 длины аллельного шага на минимально измеряемую величину;
- два фрагмента ДНК нетождественны - если при том же условии их позиции на геле отличаются более чем на удвоенную величину физической погрешности.
3.3.6. Определение размера и генотипирование фрагментов
Для индивидуализирующих ПДАФ-систем, которые основаны на использовании полиморфных локусов с дискретным распределением аллелей, применение локус-специфичных аллельных маркеров (аллельных "лестниц") позволяет относительно просто осуществлять генотипирование аллельных профилей и при условии, что в каждом эксперименте были соблюдены необходимые позиционные критерии сопоставления полос (см. выше), переходить от позиционного анализа в рамках одного эксперимента к безотносительному сравнению генотипов объектов.
В том случае, если используются другие (неаллельные) маркеры молекулярных масс, ключом к генотипированию, то есть к идентификации аллелей служит молекулярный размер (длина) амплифицированных фрагментов, определяемый расчетным путем на основании физических измерений пробега фрагментов ДНК на электрофореграмме. Однако здесь существуют важные дополнительные условия, без учета которых определение размеров амплифицированных фрагментов ДНК не всегда может гарантированно обеспечить правильную идентификацию аллелей, которым эти фрагменты соответствуют.
Чтобы определить размеры амплифицированных фрагментов ДНК по их расположению на геле в первую очередь нужно проанализировать профиль электрофоретического разделения для данного конкретного геля и для него определить точный характер зависимости электрофоретической подвижности фрагментов от их размеров. Это можно сделать, используя стандарты молекулярных масс, то есть фрагменты ДНК заранее известного размера, которые фракционируют на том же геле, что и анализируемые амодифицированные фрагменты.
По характеру применения электрофоретические стандарты молекулярных масс бывают внешними и внутренними. Внешние стандарты наносят на гель так, что они образуют самостоятельные - контрольные или маркерные дорожки. Чтобы минимизировать возможные пространственные искажения - как реальные, так и кажущиеся (параллаксные), которые влияют на точность сопоставления характеристик стандартной и анализируемой дорожек, маркерные дорожки следует располагать на геле как можно ближе к дорожкам, где движутся анализируемые фрагменты ДНК. Такой проблемы не возникает в том случае, если стандарты молекулярных масс вносят непосредственно в ту же дорожку, где фракционируют интересующие амплифицированные фрагменты (внутренний стандарт). Однако в обычной практике использование внутренних стандартов пригодно лишь для решения ограниченного круга задач; универсализация же этого подхода требует специальной приборной базы (например, многоцветной флуоресцентной детекции).
Анализ данных электрофоретического разделения стандартных (маркерных) фрагментов позволяет определить параметры кривой зависимости электрофоретической подвижности фрагментов от их размеров для данного конкретного геля и затем, используя эти параметры, рассчитать длину анализируемого фрагмента на основании величины его электрофоретической подвижности. Для этого существуют специальные расчетные алгоритмы, которые характеризуются разной степенью точности. Это надо учитывать. Кроме того, еще один важный момент заключается в следующем: принципиальное значение для всех алгоритмов имеет условие, что стандарты (маркерные фрагменты) и анализируемые фрагменты - гомологичны, то есть представлены одинаковыми полинуклеотидными последовательностями. Если это условие не соблюдено, то есть нуклеотидный состав и первичная структура анализируемой и контрольной ДНК различны, то ошибка в определении размера фрагментов может достигать нескольких процентов. (Это связано с минорными различиями в физико-химических, и как следствие, электрофоретических свойствах полинуклеотидных цепей с различным нуклеотидным составом). Таким образом, погрешность расчетов при определении размера фрагментов является важной составляющей (вместе с физической погрешностью), которую необходимо учитывать при оценке общей ошибки генотипирования, присущей данной аналитической системе в целом.
Все это означает, что генотипические характеристики, полученные расчетным путем на основании величины электрофоретической подвижности гетерологичных стандартов молекулярных масс, являются условными и потому не могут быть напрямую использованы для сопоставления как элементы банка данных - например, для сопоставления геномных профилей, полученных на разных гелях. Чтобы получить такую возможность, необходимо как минимум использовать одинаковые маркеры или же провести нормирование ошибки и осуществить коррекцию всех данных по эталону - например, по гомологичному аллельному маркеру. Последний вариант предпочтителен, поскольку позволяет оперировать не условными, а истинными генотипами, что необходимо для корректной статистической обработки данных.
 
3.4. Интерпретация результатов генотипирования
 
Достоверная нетождественность аллельных профилей ДНК трактуется в общем случае как исключение происхождения сравниваемых биологических объектов от одного индивидуума. При этом следует соблюдать следующее условие: несовпадение аллельных профилей в исследуемых препаратах ДНК имеет доказательственное исключающее значение только при том условии, что оно зарегистрировано более чем в одной ПДАФ-системе и соответствующие полиморфные локусы генетически не сцеплены. (Это требование компенсирует возможность соматических и гаметических мутаций в исследуемых локусах хромосомной ДНК).
В свою очередь, достоверная тождественность аллельных профилей ДНК не влечет безусловный вывод о происхождении сравниваемых биологических объектов от одного индивидуума. Здесь строго обязательна вероятностная оценка генетической идентичности объектов экспертизы при условии зарегистрированного совпадения их ПДАФ-профилей. Это требование диктуется необходимостью принимать во внимание возможность случайного совпадения индивидуализирующих признаков разных лиц.
Действительно, совпадение амплификационных профилей (генотипов) в препаратах ДНК, полученных из биологических следов с места преступления и в ДНК подозреваемого, еще не означает, что у этих двух ДНК общее происхождение. Иначе говоря, сам по себе факт генотипического совпадения не обязательно влечет за собой вывод о том, что следы произошли именно от этого человека; они могли произойти и от другого индивидуума, который неотличим по исследованным генетическим признакам от первого. Точно так же, в экспертизе спорного отцовства факт совпадения отцовских аллелей в генотипе ребенка с аллелями, присутствующими в геноме предполагаемого отца, еще не означает доказанного отцовства.
Это объясняется тем, что как бы ни высока была индивидуализирующая значимость анализируемых признаков, а именно, аллельных вариантов полиморфных генов, она не абсолютна. По сути, эти признаки остаются группоспецифическими, то есть в той или иной степени каждый из них распространен в популяции. Поэтому после того как в ходе экспертизы установлен факт совпадения ДНК-профилей, характеризующих объекты экспертизы, и выполнено их генотипирование, перед экспертом встает последний и самый важный вопрос:
- Если генотипические аллельные комбинации двух препаратов ДНК совпадают, то какова вероятность того, что они произошли от одного человека?
Или, в случае экспертизы спорного происхождения детей:
- Если все аллели ребенка находят комплементарное соответствие в генотипах матери и предполагаемого отца и если материнство бесспорно, то какова вероятность того, что предполагаемый отец является биологическим отцом этого ребенка?
Для того, чтобы ответить на этот ключевой вопрос и, тем самым, окончательно решить экспертную задачу, необходимо прояснить два момента. Во-первых, необходимо оценить индивидуализирующее значение выявленного комплекса признаков, то есть количественно определить насколько полученные в ходе исследования генетические признаки позволяют отграничить исследованный объект экспертизы от любого другого, ему подобного. Во-вторых, нужно правильно выбрать алгоритм расчета вероятности для оценки идентификационной значимости результатов экспертизы.
3.4.1. Оценка индивидуализирующего значения ПДАФ-профиля
Для того, чтобы определить индивидуализирующее значение выявленного геномного профиля нужно определить его распространенность в популяции. Исходным параметром популяционных выкладок, касающихся оценки распространенности признака служит величина, называемая вероятностью признака. В нашем случае - это вероятность аллеля, которая обозначается символом (p). По определению эта величина равна отношению числа аллелей данного типа к общему числу аллелей исследуемого локуса в наблюдаемой выборке. Величину (p) называют также аллельной частотой. Ее определяют эмпирически - на основании результатов популяционных исследований.
Помимо вероятности аллеля, другой важной характеристикой является частота встречаемости аллеля в популяции - так называемая статистическая частота аллеля. Она часто обозначается символом (q). Обращаем внимание, что этот параметр, хотя и созвучен аллельной частоте, отличается от нее как по величине, так и по смыслу. Для популяций, находящихся в условиях равновесия Харди-Вайнберга, величина (q) связана с величиной (p) соотношением:
 
                                         2
                               q = 2p - p .
 
Она также может быть определена на основании данных популяционных исследований: статистическая частота аллеля - это отношение числа генотипов, в которых присутствует данный аллель, к общему числу всех возможных генотипов в популяционной выборке.
Из этого определения следует, что, например, в экспертизе спорного отцовства именно статистическая частота аллеля (q) должна фигурировать как мера распространенности в популяции индивидуализирующего признака, присущего сравниваемым субъектам (ребенку и предполагаемому отцу) и используемого в целях идентификации биологического отца ребенка. Иными словами, это и есть мера индивидуализирующего значения признака, в данном случае - аллеля: величина (q) служит тем параметром, который определяет шансы любого (случайного) мужчины, имеющего данный аллель в генотипе, считаться биологическим отцом любого ребенка, у которого этот конкретный аллель был идентифицирован как отцовский.
    В   случае   же   экспертизы   идентификации   личности,   в   качестве
индивидуализирующего    признака,   имеющего   идентификационное   значение
выступает  уже  не  отдельный  аллель, а целиком генотип. Напомним, что для
каждого отдельного локуса это - комбинация двух аллелей, которые могут быть
разными   (a1;  a2  -  гетерозиготное  состояние),  а  могут  оказаться   и
одинаковыми   (a1;   a1   -  гомозиготное  состояние).  Поэтому  здесь  для
количественной  оценки  индивидуализирующего  значения  признака используют
статистическую   частоту   генотипа,   а  именно  -  частоту  встречаемости
конкретного  профиля  ДНК  в  популяции.  Эту  величину  иногда  обозначают
символом  (Q);  ее определяют эмпирически на основании данных популяционных
исследований  или  же рассчитывают, исходя из величины вероятности каждого
аллеля   (p    и  p  )   на   основании   закономерностей    менделеевского
           a1      a2
наследования.  Для  гетерозиготного  и  гомозиготного  генотипов  расчетные
величины (Q)соответственно таковы:
 
                               Q = 2 х p   х p  ,
                                        a1    a2
 
                                      2
                                 Q = p  .
                                      a1
 
    Важно  однако  подчеркнуть,  что  в  современной  мировой  практике для
расчета статистической частоты гомозиготных профилей вместо выражения:
 
                                      2
                                 Q = p
                                      a1
 
обычно применяют искусственную, но более консервативную оценку:
 
                                  Q = 2p.
 
Это делается для компенсации эффекта ложной гомозиготности. (Приведенные формулы справедливы только для популяций, находящихся в условиях равновесия Харди-Вайнберга).
Таким образом, в случае идентификационного исследования величина (Q) служит параметром, который определяет шансы любого (случайного) человека, имеющего данный генотип, считаться именно тем лицом, от которого произошла любая ДНК с этим генотипом.
Если индивидуализация объекта экспертизы осуществляется по нескольким независимым (несцепленным) ПДАФ-системам, то для целей совокупной оценки индивидуализирующего значения выявленного комплекса признаков их статистические частоты могут быть перемножены. Следовательно, количественная оценка индивидуализирующего значения нескольких геномных профилей, полученных для панели несцепленных полиморфных локусов, будет определяться как произведение статистических частот всех генотипов - в идентификационной экспертизе или всех отцовских аллелей ребенка - в экспертизе спорного отцовства. Иными словами, для совпадения, зарегистрированного по нескольким несцепленным локусам: a, b,...n:
 
                          Q = (Q  х Q  х Q  х...Q ),
                                a    b    c      n
 
    где Q  - статистическая частота n-го локального генотипа.
         n
    Аналогично,  при  вероятностной  оценке результатов экспертизы спорного
отцовства,   когда   по   нескольким   локусам   не   получено   исключения
ложноуказанного отца:
 
                        q = (q  х q  х q  х...q ),
                              a    b    c      n
 
    где q - общая статистическая частота всех отцовских аллелей, выявленных
в генотипе ребенка.
3.4.2. Вычисление вероятности генетической идентичности объектов экспертизы и вероятности отцовства
Стандартные в зарубежной судебно-экспертной практике величины "инкриминирующее значение" (англ. - Incriminating Value, IV) и "индекс отцовства" (англ. - Paternity Index, PI), математически - суть отношения правдоподобия, которые призваны ответить на вопрос: во сколько раз более вероятно, что выявленные в ходе анализа индивидуализирующие признаки совпадают закономерно (например, когда исследуемые образцы ДНК произошли от одного человека), а не случайно (то есть, когда они принадлежат двум разным членам популяции).
В количественном выражении:
 
IV = 1 / Q.
 
Аналогичная по смыслу величина - индекс отцовства PI:
 
PI = 1 / q.
 
Однако, строго говоря, вычисление PI и IV не дает ответа на главный вопрос, призванный количественно охарактеризовать доказательственное значение экспертизы: если совпадение признаков установлено, то какова вероятность, что это совпадение закономерно, а не произошло по воле случайности? Ответить на этот вопрос можно, используя формулу вычисления условной вероятности, выведенную Байесом (Bayes). Общий смысл этой формулы в том, что зная так называемую априорную ("до опыта") вероятность интересующего нас некоего события (например, происхождения ДНК от этого или же от другого человека), мы можем определить величину постериорной ("после опыта") вероятности этого же события при условии, что уже произошло другое событие, имеющее определенное отношение к первому (например, амплификационные профили испытуемой ДНК и ДНК этого идентифицируемого человека совпали).
Априорную вероятность в общем случае принято считать равной 0,5. (Надо подчеркнуть, что хотя эта величина и не является бесспорной, изменение оценки априорной вероятности не входит в компетенцию эксперта и является прерогативой суда). Можно показать, что подставляя это и другие соответствующие рассматриваемому случаю значения величин в формулу Байеса, мы получим выражение, определяющее конечную постериорную вероятность того, что при наблюдаемом совпадении геномных профилей исследованные образцы ДНК идентичны. Эта байесова вероятность генетической идентичности геномных профилей иногда называется инкриминирующей вероятностью IP от англ.: Incriminating Probability:
 
IP = 1 / (1 + Q),
 
где Q - это частота генотипа.
(Следует оговориться, что подобный расчет приемлем только в том случае, если происхождение генетического материала от подозреваемого не исключается другими методами, и если следы оставил один человек.)
Аналогично, в случае неисключающей экспертизы спорного отцовства, байесова постериорная вероятность того, что при наблюдаемом совпадении отцовского аллеля в геномном профиле ребенка с одним из аллелей предполагаемого отца этот мужчина является его биологическим отцом, называется вероятностью отцовства PP (англ. - Paternity Probability) и выражается формулой:
 
PP = 1 / (1 + q),
 
где q - статистическая частота отцовского аллеля, выявленного в геномном профиле ребенка.
Обе эти вероятности часто выражают в процентах: PP х 100 = %.
 
Эффективность использования метода и показания к применению
 
В настоящее время экспертные исследования биологических объектов с использованием методов молекулярно-генетической индивидуализации человека прочно вошли в арсенал судебно-медицинских служб большинства развитых стран мира. Более чем десятилетний мировой опыт внедрения этих технологий в практику работы правоохранительных органов убедительно свидетельствует о том, что благодаря им эффективность расследования многих тяжких преступлений против личности может быть существенно повышена.
С точки зрения задач судебно-медицинской экспертизы использование анализа ПДАФ наиболее эффективно в двух случаях: это идентификация личности и установление биологического родства.
Речь может идти об идентификации личности при расследовании убийств, тяжких телесных повреждений, изнасилований и других преступлений против личности, требующих судебно-медицинского исследования вещественных доказательств, а также при опознании расчлененных, сильно деформированных, обгоревших трупов - в случае массовых катастроф, взрывов, землетрясений и военных конфликтов.
В то же время, геномная "дактилоскопия", как иногда называют вышеописанный анализ ПДАФ, в отличие от традиционной криминалистической дактилоскопии позволяет не только однозначно устанавливать личность, но также определять кровное родство лиц. Это делает ее незаменимым экспертным методом в сложных случаях подмены, утери, похищения детей, определения родства малолетних или потерявших память лиц, выявления фактов кровосмешения. Метод также весьма эффективно используется и при решении гражданских дел - для установления отцовства или материнства.
 
 


Вы здесь » Форум по медицинскому праву » Федеральное законодательство » Судебное разбирательство дел об установлении отцовства